【摘 要】
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硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)是由葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GlcA)或艾杜糖醛酸(iduronic acid,IdoA)和N位点硫酸化或乙酰化的葡糖胺(glucosamine,GlcN)之间以糖苷键
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硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)是由葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GlcA)或艾杜糖醛酸(iduronic acid,IdoA)和N位点硫酸化或乙酰化的葡糖胺(glucosamine,GlcN)之间以糖苷键连接的重复二糖单位组成的糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)。HS广泛存在于哺乳动物细胞和内皮细胞表面。通常区别HS和肝素(heparin,HP)的一个重要特征是N位点硫酸化修饰的程度。一般来说,HP的N-磺化程度高于70%,而HS通常低于50%,这与O-硫酸化程度的差异一致。HP是一种具有明确生物活性的大分子直链多糖,它除了具有抗凝活性外,还具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗感染和抗增殖的特性,这些活性是通过HP与蛋白质的相互作用来介导的。Heparosan是未经硫酸化的HP骨架,它与某些细菌荚膜多糖的结构一致。Heparosan可以作为前体物质合成具有抗凝活性的非动物来源的HP,或者非抗凝的HP衍生物。Heparosan制备方法主要包括细菌发酵提取以及体外酶法合成等。研究发现 Escherichia.coli O10:K5:H4(ATCC23506)以及Pasteurella multocida中的一些糖基转移酶(glycosyltransferases,GTs)能够合成heparosan。随着糖类药物的不断发展,在体外合成结构均一和确定的非动物来源的HP已经成为了研究的重点。通过模拟体内HP的生物合成过程,使用高效、专一的GTs合成heparosan,进而使用化学法或酶法对其进行异构化和硫酸化修饰。这种基于化学酶法合成HP已发展成为一套成熟的仿生合成体系。这种合成方法产率高,且能合成结构确定的HP。因此heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶(KfiAs)对合成非动物来源的HP具有很高的应用价值。KfiA 属于 Carbohydrate-Active enZYmes Database(CAZy)GT45 家族成员。但是目前为止,该家族成员就只有来自E.coli O10:K5:H4的EcKfiA。已知成员数量的不足限制了对KfiA超家族的分子结构和催化机理的研究,并限制了该酶家族在糖聚合物合成中的应用。发掘该家族新成员,并进行催化机理、关键氨基酸位点的研究不但具有重要的理论意义,而且为未来通过蛋白质工程改造KfiA,获得催化特性更为优秀的HP骨架合酶奠定了基础。因此,本论文就是围绕以上内容所展开,包括以下几个内容:1.自卡氏杆菌(Gallibacterium anatis)中发掘了一个KfiA家族新成员:通过生物信息学分析,G.anatis gcbd基因编码的酶与来源于E.coli O10:K5:H4的heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶EcKfiA的蛋白一级结构表现出很高的同源性(～58%);成功实现该酶(命名为GaKfiA)在E.coli表达体系中的可溶重组表达,并建立了重组酶分子的蛋白纯化方法;以GlcA-pNP为受体底物,UDP-GlcNAc为单糖供体,系统分析了 GaKfiA酶促反应生成的二糖的化学结构,确定GaKfiA表现出明确的heparosan-α-1,4-GlcNAc转移酶活性。2.完成了 GaKfiA的动力学以及酶学性质的研究,并分析了该酶分子的供体底物特异性。3.确定了 DXD基序对KfiA家族成员催化活性的关键影响作用:通过蛋白-分子对接模型分析了 DXD基序对KfiA家族催化活性的影响;经过理性突变,重组获得突变分子GaKfiA(N56D);系统比较了 GaKfiA(N56D)与GaKfiA的酶促反应动力学数据,明确了 GaKfiA的关键氨基酸位点。4.成功实现KfiA家族成员催化活性的表面展示:借助于冰核蛋白(ice nucleation protein,INP)将EcKfiA重组表达在大肠杆菌的表面;表面锚定表达EcKfiA的重组菌体具备将GlcA-pNP延长为肝素骨架结构二糖(GlcNAc-GlcA-pNP)的活性。
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