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Hutchinson—Gilford早老症(HGPS)是一种罕见的遗传性疾病,其临床特征为患者幼年时期即出现衰老症状并累及多种组织器官,包括皮肤、肌肉、骨骼以及心血管系统。HGPS伴发有老年人常见的并发症,并最终导致死亡,该疾病患儿的平均寿命约13.5岁。HGPS是由于LMNA基因的点突变干扰了A型核纤层蛋白前体(prelamin A)翻译后的加工过程,从而导致异常prelamin A在细胞核堆积的结果。Zmpste24是参与由prelamin A形成成熟的核纤层蛋白A(lamin A)过程所必须的酶。Zmpste24基因敲除小鼠具有典型的早老表现,是目前研究细胞衰老机制的首选模型。瞬时性受体电位通道(transient receptor potential,TRP)是参与调节胞内钙离子平衡的一种通道,广泛表达于哺乳动物的多种组织中,并参与调节例如细胞增殖、细胞凋亡、递质释放、细胞分化、基因转录等诸多重要的生理功能。研究发现由早老症患者的内皮细胞诱导的多能干细胞高表达TRPV2,最终导致细胞凋亡,与细胞衰老密切相关。但是TRP通道对骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenehymal stem cells,BMMSCs)功能的影响尚少有报道,并且TRP通道如何影响细胞衰老的机制也尚不明确。细胞衰老涉及毒性代谢物的积累、DNA损伤、线粒体代谢紊乱等方面,这些衰老的表现都与氧化应激相关。因此本实验通过比较Zmpste24-/-早老小鼠与野生型小鼠BMMSCs的衰老情况、增殖能力、凋亡水平、TRP通道的表达情况以及TRP通道与氧化应激的关系,进一步探讨TRP通道对于细胞衰老的影响及其可能存在的调控机制。[实验目的]1.比较Zmpste24-/-基因敲除、野生型小鼠BMMSCs的衰老情况、增殖能力和凋亡水平;2.比较Zmpste24-/-基因敲除、野生型小鼠BMMSCs的TRP通道表达情况,筛选与细胞增殖、凋亡相关的TRP通道;3.初步探讨TRP通道影响细胞增殖凋亡的机制。[实验方法]1.利用全骨髓贴壁培养法分离培养、纯化Zmpste24-/-、野生型小鼠BMMSCs,流式鉴定间充质干细胞的表面标志物,并进行克隆形成的鉴定;2.利用Edu检测两种小鼠BMMSCs的增殖能力,流式细胞技术检测细胞周期的情况;Annexin V-FITC/PI双染法检测凋亡能力,β-半乳糖苷酶染色检测两种小鼠BMMSCs的细胞衰老情况;RT-PCR检测BMMSCs的细胞周期相关蛋白Cyclin D1、CDK1、CDK4、CDK6及衰老相关基因P16、P21、P53的表达水平。3.RT-PCR检测两种小鼠BMMSCs的TRP通道表达情况,通过无血清培养(抑制增殖)和H2O2处理(促进细胞凋亡)筛选出影响BMMSCs增殖凋亡的TRP通道;并通过Western-Blot技术检测该通道的表达;4.抑制TRPM8通道的表达检测BMMSCs细胞增殖能力及氧化应激水平的变化。[实验结果]1.分离纯化后,WT的BMMSCs呈梭形,细胞个体小,细胞立体感强;Zmpste24-/-的BMMSCs细胞呈扁平形,个体较大,立体感差;两种小鼠的BMMSCs均阳性表达Sca-1、CD73,阴性表达CD34、CD45,符合间充质干细胞的特性;Zmpste24-/-、WT小鼠的BMMSCs通过克隆均能形成集落,其中Zmpste24-/-小鼠的BMMSCs形成集落速度慢,集落数目少,WT小鼠的BMMSCs形成的集落染色深,大于50个细胞的集落数目较多(p<0.05)。2.Edu检测结果显示,Zmpste24-/-小鼠BMMSCs的增殖能力明显低于WT(p<0.05);流式细胞仪检测细胞周期结果显示Zmpste24-/-小鼠BMMSCs G0/G1期细胞所占比例比WT高,G2期、S期细胞所占比例均比WT低(p<0.05)。FITC/PI双染法结果显示Zmpste24-/-小鼠BMMSCs凋亡水平明显高于WT(p<0.05);SA-β-gal染色显示,Zmpste24-/-小鼠BMMSCs的衰老细胞数目明显多于WT(p<0.05)。RT-PCR结果显示:Zmpste24-/-小鼠BMMSCs的Cyclin D1、CDK1、CDK4、CDK6的表达水平低于WT小鼠(p<0.05),而P16、P21、P53基因的表达水平明显高于WT小鼠(p<0.05)。3.RT-PCR检测结果显示,Zmpste24-/-小鼠BMMSCs中的TRPC1、TRPM4、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV5通道表达水平均明显高于WT小鼠(p<0.05)。对WT的BMMSCs进行12h的无血清培养后TRPC3、TRPC7、TRPM8、TRPV5的表达水平显著升高(p<0.05);含500μmol/L H2O2的培养液处理12h后TRPM8、TRPV3表达水平明显升高(p<0.05)。Western-Blot检测结果显示:Zmpste24-/-小鼠的BMMSCs TRPM8蛋白表达水平高于WT小鼠。4.Zmpste24-/-小鼠BMMSCs高表达MDA,而SOD2、CAT的表达水平明显低于WT小鼠(p<0.05);2-APB抑制TRPM8表达后Zmpste24-/-小鼠BMMSCs的G1期细胞比例下降,G2+M期细胞比例增加(p<0.05);SOD2、CAT的表达水平明显升高(p<0.05),MDA的表达水平明显降低(p<0.05)。[结论]1.Zmpste24-/-小鼠BMMSCs出现衰老细胞的特征,表现为细胞扁平形,个体较大;克隆形成能力差,增殖能力低,凋亡水平高,处于有丝分裂期的细胞数目少,低表达Cyclin D1、CDK1、CDK4、CDK6,高表达P16、P21、P53;高表达MDA,低表达SOD2,CAT,细胞处于氧化应激状态。2.Zmpste24-/-小鼠BMMSCs高表达TRPM8且TRPM8与H2O2诱导的细胞凋亡相关。3.抑制TRPM8的表达后Zmpste24-/-小鼠BMMSCs增殖能力提高,细胞氧化应激水平降低,抗氧化能力增强。