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中药白屈菜（Chelidonium majus L.）为罂粟科白屈菜属多年生草本植物白屈菜的干燥全草。其味苦辛,性微温,有毒;具有镇痛,利尿,止咳,清热解毒等疗效。白屈菜主要成分为生物碱,白屈菜碱是其中之一。研究表明,白屈菜碱对乳腺癌、肝癌、膀胱癌、宫颈癌、胰腺癌、直肠癌等均有显著的抗肿瘤作用,已引起了国内外学者的广泛关注。本课题组前期研究发现,白屈菜碱不仅对人胃癌SGC-7901细胞、人乳腺癌MCF-7细胞具有良好的抗肿瘤作用,并能对人乳腺癌耐阿霉素MCF-7/ADR细胞具有显著的增殖抑制作用,降低P-gp蛋白的表达量,同时逆转细胞的耐药性。因此本文在前期研究基础上,采用网络药理学方法及实验验证进一步探究白屈菜碱逆转人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR对阿霉素（ADR）的耐药作用及机制,为其开发成肿瘤耐药逆转剂及临床应用提供一定的科学依据。本实验首先采用网络药理学预测白屈菜碱抗乳腺癌的核心靶点及作用机制,结果表明从TCMSP数据库、Swiss Target Prediction数据库及文献挖掘共获得白屈菜碱作用靶点65个,从OMIM数据、GAD数据库、Pharmgkb数据库得到乳腺癌相关靶点共653个。绘制白屈菜碱-疾病交集PPI网络,筛选出核心靶点,运用DAVID数据库对白屈菜碱作用乳腺癌的核心靶点进行GO和KEGG分析,共涉及30个通路,其中包含14条癌症通路,16条信号通路。16条信号通路中与乳腺癌耐药相关的通路为10条。基于前期研究表明白屈菜碱可通过降低P-gp逆转乳腺癌细胞耐药性,因此本文将进一步研究其作用机制,有文献表明网络药理学预测的10条通路中PI3K/AKT、MAPK、Foxo、Cell cycle、HIF-1可对P-gp进行调控,通路涉及的核心靶点数依次为PI3K/AKT＞MAPK＞Foxo＞Cell cycle＞HIF-1。结合实验目的与网络药理学结果,我们选取前两条通路进一步实验验证。在此基础上,在验证白屈菜碱逆转乳腺癌耐ADR作用后,进一步研究白屈菜碱是否通过作用于PI3K/AKT通路逆转MCF-7/ADR细胞的耐药,验证网络药理学的预测结果,并阐明白屈菜碱逆转乳腺癌耐药的可能机制。MTT法测定白屈菜碱联合ADR对MCF-7/ADR细胞增殖抑制作用,其中单独应用ADR处理的对照组中MCF-7/ADR细胞株的IC50为27.96?1.10μmol?L-1,1.5、3、6μmol?L-1的白屈菜碱联合ADR后MCF-7/ADR的IC50下降至14.69?0.28、8.37?0.28、6.21?0.43μmol?L-1,经计算,逆转倍数分别为1.90、3.34、4.50倍。流式细胞仪检测各组细胞内ADR荧光蓄积量分别为:只用ADR组15.7%?0.49、1.5μmol/L白屈菜碱联合ADR组48.2%?2.7,3μmol/L白屈菜碱联合ADR组54.6%?0.05,6μmol/L白屈菜碱联合ADR组56.6%?1.3,与ADR组比较荧光强度显著增高（P＜0.05）。实验结果表明白屈菜碱可降低细胞对ADR的耐药性,增加细胞对ADR的吸收,且在一定浓度范围内呈剂量依赖关系。Western blotting法测定ADR单独及不同剂量的白屈菜碱(1.5、3、6μmol?L-1)联合ADR(6μmol?L-1)处理乳腺癌MCF-7/ADR耐药细胞中P-gp、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、PTEN、p-IKK、p-IKB、NF-?B蛋白表达的影响,结果表明,与空白对照组比,ADR单独处理细胞组中各蛋白表达水平均无显著变化（P＞0.05）;不同浓度白屈菜碱组与空白对照组比较,P-gp、p-AKT、p-PI3K蛋白表量显著下降（P＜0.01）,而PTEN蛋白表达水平逐渐增高（P＜0.01）,细胞内AKT、PI3K蛋白表达量未发生明显变化（P＞0.05）;不同浓度白屈菜碱组与空白对照组比,细胞中p-IKK、p-IKB、NF-?B均显著降低（P＜0.05）,并呈一定的剂量依赖关系。实验结果表明,白屈菜碱能通过PI3K/AKT通路逆转MCF-7/ADR细胞对ADR的耐药性,P-gp蛋白表达量下降可能与激活PI3K/AKT通路有关。由于药物调控肿瘤细胞的信号通路及机制多样且复杂,本实将验进一步采用AKT抑制剂阻断AKT磷酸化后再测定P-gp蛋白的表达,观察白屈菜碱调控P-gp蛋白表达和逆转耐药作用是否还涉及其他机制。应用荧光显微镜观察到AKT抑制剂MK-2206培养24h后,空白对照组与单独用ADR处理组细胞内Rh123和ADR荧光强度较低,而ADR联合白屈菜碱后荧光强度增强。Western Blot法测定加入MK2206后细胞中P-gp蛋白表达的影响,发现白屈菜碱联合ADR组P-gp表达仍显著降低（P＜0.01）,说明除PI3K/AKT通路以外,白屈菜碱调控P-gp表达逆转耐药作用还涉及其他通路。因此,本文根据网络药理学的预测结果,又对MAPK信号通路是否参与白屈菜碱逆转乳腺癌细胞耐药进行验证。采用Western Blot法测定ADR单独及不同剂量的白屈菜碱(1.5、3、6μmol?L-1)联合ADR(6μmol?L-1)处理乳腺癌MCF-7/ADR耐药细胞后细胞中p38、p-p38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表达的影响。研究结果表明,与对照组相比,ADR单独处理细胞后各蛋白表达水平无显著变化（P＞0.05）,而随着白屈菜碱浓度的增加,细胞内p-p38、p-ERK蛋白表达水平均显著下（P＜0.01）;同时,白屈菜碱(3、6μmol?L-1)联合ADR(6μmol?L-1)处理MCF-7/ADR细胞后,细胞内p-JNK蛋白表达水平也显著降低（P＜0.01）;而各处理组细胞中的p38、ERK、JNK蛋白表达水平未发生明显变化,与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。实验结果表明,MAPK通路也可能是白屈菜碱降低MCF-7/ADR细胞P-gp表达水平进而逆转人乳腺癌耐药的主要调控通路之一。综上所述,白屈菜碱能有效逆转MCF-7/ADR细胞对ADR的耐药性,其机制可能与白屈菜碱抑制PI3K/AKT和MAPK通路,进而降低P-gp表达水平有关。但其逆转乳腺癌耐药作用是否涉及到其他细胞信号转导途径及机制还有待进一步研究。