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花鲈(Lateolabrax japonicus)是中国南方重要的经济鱼类,近年来随着养殖模式的扩大和水环境的恶化,导致水环境中的病菌极易爆发流行,这极大限制了花鲈养殖业的发展。非特异免疫是鱼类抵御外界病菌刺激的第一道防线,其免疫激活主要通过特异性识别一系列病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)来实现。其中Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)是一类至关重要的PRR,属于Ⅰ型跨膜受体,能够抵御病原体感染。TLR结构具有高度的保守性,主要包含胞外的富含亮氨酸重复区域(LRR)、跨膜区和胞内的TIR受体区(Toll/interleukin-1 receptor,TIR)。TLR主要通过LRR接受胞外刺激信号,通过TIR与衔接蛋白的结合继续信号转导,激活核因子NF-κB免疫途径,产生炎症因子消灭病菌。因此,本实验筛选克隆得到花鲈LjTLR1、LjTLR3、LjTLR5三个TLR基因,进行细菌刺激,以期研究三个TLR基因对病原菌的抵御作用。本文根据从转录组筛选得到的LjTLR1、LjTLR3、LjTLR5基因片段,利用RACE PCR技术获得三个TLR基因cDNA序列全长,利用不同软件进行序列生物信息学分析,进一步利用实时荧光定量PCR技术分析TLR基因的组织表达分布。鉴于TLR蛋白对PAMP的抵抗作用,利用哈维弧菌(Vibrio harveyi)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)注射刺激花鲈,研究三个TLR基因在面对不同病菌刺激后的表达差异。利用原位杂交技术进一步确定病菌对TLR基因的表达影响。利用细胞转染技术将三个TLR基因的真核重组质粒转入人胚肾293T(HEK-293T)细胞中,以期初步探究三个TLR蛋白的细胞定位。具体研究结果如下:(1)LjTLR1、LjTLR3、LjTLR5基因cDNA全长分别为2755、3265和3907bp,开放阅读框分别包含2484、2769和2676bp。LjTLR1蛋白理论分子量大小和等电点分别是93.55 kDa和6.56,LjTLR3的是103.85 kDa和8.73,LjTLR5的是101.15 kDa和6.10。三个基因都具有典型的TLR蛋白结构域:LRR、LRRCT、跨膜区和TIR结构域,只是LRR的数量有所不同。多重序列比对结果显示,LjTLR1、LjTLR3、LjTLR5氨基酸序列与其他鱼类的相似性更高。系统进化树也显示,三个TLR基因在进化关系上与鱼类更为接近,而与哺乳动物有一定的遗传距离。(2)组织分布表达结果显示,LjTLR1、LjTLR3、LjTLR5在检测组织中均有表达,并且在免疫组织中具有高表达水平。LjTLR1在头肾、肠和肝脏中表达较高,在肌肉中表达最低;LjTLR3在脾脏、头肾和肝脏中表达较高,在心脏中表达最低;LjTLR5在头肾、肌肉和肠中表达较高,在肝脏中表达最低。(3)经哈维弧菌和无乳链球菌刺激后,LjTLR1、LjTLR3、LjTLR5在免疫组织中均有显著表达上调,在肌肉中表达上调比例较平稳,而且哈维弧菌的刺激程度要高于无乳链球菌。经哈维弧菌刺激后,头肾中三者表达均显著上调,均在6h开始显著的表达上调,LjTLR1、LjTLR3、LjTLR5的最高表达量分别出现在48h、48 h和24 h;脾脏中三者表达均显著上调,均在6 h开始表达上调,LjTLR1、LjTLR3、LjTLR5基因的最高表达量分别出现在48 h、48 h和24 h。肝脏中三者表达均显著上调,均在6 h开始表达上调,LjTLR1、LjTLR3、LjTLR5基因的最高表达量分别出现在72 h、24 h和24 h。经无乳链球菌刺激后,头肾中三者表达均显著上调,均在6 h开始表达上调,LjTLR1、LjTLR3、LjTLR5基因的最高表达量分别出现在72 h、96 h和24 h;脾脏中三者表达均显著上调,均在6 h开始表达上调,LjTLR1、LjTLR3、LjTLR5基因的最高表达量分别出现在48 h、48 h和24h;肝脏中三者表达均显著上调,均在6 h开始表达上调,LjTLR1、LjTLR3、LjTLR5基因的最高表达量分别出现在24 h、6 h和6 h。在肌肉中三者均在免疫后期才开始出现较显著的表达上调。(4)原位杂交结果显示,在脾脏和头肾中,PBS处理后仅监测到少量阳性信号,而经不同菌刺激后LjTLR1、LjTLR3、LjTLR5的阳性信号明显多于PBS对照组。在经不同处理的同一组织中,哈维弧菌的LjTLR1、LjTLR3、LjTLR5阳性信号要明显强于无乳链球菌。这也就进一步证明了LjTLR1、LjTLR3、LjTLR5在面对细菌刺激时的表达特征,均出现了显著的表达上调。(5)本文成功构建了真核重组表达质粒,LjTLR1、LjTLR3、LjTLR5三个TLR重组蛋白在HEK-293T细胞中成功表达。三个TLR重组蛋白定位均在细胞质和膜附近,说明三者可能都属于典型的TLR蛋白。