论文部分内容阅读
1,3-丙二醇(1,3-PDO)是一种重要的二醇化合物,是polytrimethylene terephthalate(PTT)等聚酯纤维合成不可替代的重要原料。Klebsiella pneumoniae(K.pneumoniae)作为天然的 1,3-PDO生产菌株,可利用甘油为原料,具有耐受性好、生长快等优点,但因胞内同工酶及副产物众多,NADH供应不足等问题,导致菌株生产效率不高,而且途径改造具有不确定性。针对甘油途径合成1,3-PDO的这些问题,本论文以1,3-PDO的生物合成系统为研究对象,应用辅因子和碳代谢的耦合优化策略,实现1,3-PDO的高效合成。本论文首先对K.pneumoniae的甘油途径进行了优化,之后对NADH调控与碳代谢之间的关系进行了研究,并构建了多种调控模块定向驱动1,3-PDO合成,表明将物质代谢与能量代谢调控模块耦合,是使1,3-PDO代谢流最大化和快速化的重要策略,可从根本上提升菌株对于1,3-PDO的生产能力。非天然代谢途径的设计与重构对于拓展细胞的生产能力和用于化学品生产具有重要意义,目前已有许多成功案例。基于葡萄糖途径生产1,3-PDO的研究进展,本论文设计并构建了全新的1,3-PDO非天然合成途径,拓宽了微生物合成1,3-PDO的路线。与杜邦公司葡萄糖经甘油途径合成1,3-PDO相比,不需要VB12的添加;与葡萄糖经高丝氨酸途径合成1,3-PDO相比,途径较短,涉及到的未知酶较少。因此,基于以上两个研究方向,本论文的主要研究结果如下:1.K.pneumon a 甘油途径的优化:为了有效减少副产物合成的代谢通量,提高菌株耐受力和生产效率,利用易错PCR和同源重组技术,对微生物内源的甘油途径进行了优化,菌株1,3-PDO耐受能力提高了 36.0%,1,3-PDO 的产量提高 62.5%,2,3-丁二醇(2,3-BDO)和乳酸的产量分别降低了 40.0%和98.0%;为了实现甘油和葡萄糖的共同利用,敲除了磷酸葡萄糖转移酶系统关键酶编码基因crr,1,3-PDO的浓度提高了 25.0%,生产强度提高至2.26g/L·h,甘油转化率提高至0.52 mol/mol,为后续研究提供了适宜高效生产1,3-PDO的底盘微生物。2.甘油转运系统与NADH再生系统的构建对1,3-PDO合成的影响:为了研究1,3-PDO合成中NADH调控与碳代谢之间的相互关系,构建了甘油转运系统和NADH再生系统。甘油转运系统的构建最多可将甘油消耗速率提高90%以上,1,3-PDO的发酵浓度提高12.2%,同时也提高了胞内NADH/NAD+的比率;NADH再生系统的构建将胞内 NADH/NAD+提高了 27.4%。1,3-PDO 最高浓度达到 86.1 g/L,生产强度提高至2.69 g/L·h,甘油转化率提高至0.59 mol/mol,1,3-PDO的浓度、生产强度和转化率分别提高了 26.4%、19.0%和13.5%。以上结果表明,碳代谢的调控不仅改变碳代谢的分布,还影响胞内辅因子的存在方式和浓度,同时,能量代谢的调控也会重新定向胞内代谢流的分配。3.耦合调控策略对1,3-PDO合成系统的优化:为了解决1,3-PDO合成过程中还原力和碳代谢通量不足的问题,利用Entner-Doudoroff(ED)途径的构建、转氢酶和1,3-PDO氧化还原酶(PDOR)的强化表达、反义RNA(asRNA)弱化的耦合策略提高胞内NADH/NAD+的比率和1,3-PDO碳代谢通量,定向驱动1,3-PDO合成,1,3-PDO浓度达到83.3 g/L,甘油转化率达到0.62 mol/mol。ED途径的构建和PDOR的表达不仅加快了 NADH和NADPH的合成,还促进了葡萄糖和甘油的利用,胞内辅酶I浓度提高了 59.9%,辅酶II浓度提高了66.8%,NADH/NAD+和 NADPH/NADP+的比率分别提高了 58.9%和30.3%;转氢酶的表达有效改变胞内辅酶I和辅酶II的存在形式,NADH/NAD+比率进一步提高了 21.3%;asRNA策略将碳代谢竞争途径(2,3-BDO途径)弱化,弱化效率达50%以上。NADH/NAD+的波动不仅会重新定向胞内代谢流的分布,还对中心碳代谢相关基因的转录造成影响。4.物质和能量平衡对1,3-PDO合成系统的影响:为了兼顾菌株的生长代谢与产物高效合成,避免原料和能量的浪费,利用基于CRISPRi、辅酶偏好性和核糖开关的耦合调控策略维持胞内物质与能量的相对平衡。运用CRISPRi技术对胞内竞争消耗NADH的产物途径进行弱化,实现了胞内NADH和1,3-PDO的提高,2,3-BDO、乙醇和乙酸浓度分别降低了 12.3%、55.6%和51.9%,1,3-PDO和NADH浓度分别提高63.3%和34.6%;通过定点突变改变了 PDOR的辅因子偏好性,多位点突变株的产量提高了 58.2%;应用ATP响应的核糖开关ydaO调控胞内ATP和乙酸的浓度,进一步提高产物浓度和菌株的生长;三种策略耦合后,摇瓶发酵中甘油转化率达到0.64 mol/mol;与辅酶偏好性单一策略调控相比,菌株的生物量和1,3-PDO产物浓度分别提高了 19.3%和56.5%;与CRISPRi单一策略调控相比,菌株的生物量和1,3-PDO产物浓度分别提高了 6.9%和14.0%。5.葡萄糖合成1,3-PDO新途径的探索:利用代谢途径的反向合成方法,结合在线数据库分析,对1,3-PDO可行的生物合成途径进行了挖掘和分析,得到可行的非天然1,3-PDO合成途径;通过关键酶来源的筛选,在K.pneumonia.菌和E.coli菌中构建经由succinyl-CoA的1,3-PDO新途径,其中最优重组菌株的摇瓶产量为244 mg/L。