载HSV-TK基因的靶向超声微泡制备及体外寻靶实验

来源 :重庆医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:tenhuanggou
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
第一部分:靶向脂质超声微泡的制备目的:制备一种脂质超声微泡作为载体,使其粒径为纳米级,并实现其与肝癌细胞特异性抗体的偶联。方法:1.将DPPA、Bio-DSPE按一定摩尔比溶解于有机溶液中,待有机溶液挥发后,形成白色粉末样物质,取出一定量的混合物,加入甘油、PBS缓冲液,45℃水浴后注入C3F8气体采用机械震荡法即可制备出超声微泡。将制备好的超声微泡光镜下观察其形态,粒径仪测定其粒径大小及表面所带zata电位。2.将制备出的超声微泡通过生物素-亲和素系统实现其与抗体的偶联,即在已制备的超声微泡中加入过量的链霉亲和素,再加入生物素化GPC3单克隆抗体即可。加入FITC标记的二抗在激光共聚焦显微镜下观察靶向微泡的形态,流式细胞仪检测标记上抗体的微泡比率。结果:1.制备出的超声微泡成圆形,大小较均一,平均粒径在528nm左右,所带平均电荷为-22mv。2.靶向超声微泡在免疫荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察,于蓝光激发波下可见微泡中心为黑色,周围有一圈绿色的荧光,表明GPC3单克隆抗体已经特异性结合于微泡表面,经流式细胞仪检测约85%的超声微泡标记上抗体。本课题授国家自然科学基金面上项目支持(NO:81272570)结论:1.制备出的超声微泡呈圆形、大小较均一,稳定性较好,其粒径为纳米级,满足本次实验要求。2.通过生物素-亲和素系统实现了超声微泡与GPC3单克隆抗体的偶联,为靶向识别及后续研究提供基础。第二部分肝癌细胞体外寻靶实验目的:实现连接有GPC3单克隆抗体的超声微泡(即靶向超声微泡)与人肝癌HepG2细胞特异性结合。方法:1.分别培养人肝癌HepG2细胞株、人肝脏L02细胞株,细胞免疫组化实验,检测证实肝细胞型肝癌(HCC)细胞膜表面有特异性GPC3抗原的表达。2.将人肝癌HepG2细胞株、人正常肝脏L02细胞株、人乳腺癌细胞株MCF-7经DiI染色,于激光共聚焦培养皿中加入经FITC标记二抗后的靶向超声微泡,待其充分结合后通过激光共聚焦显微镜检测其靶向性。结果:1.人肝癌细胞膜表面有抗GPC3特异性抗原表达,而正常肝脏L02细胞表面并没有表达。2.靶向超声微泡能特异性结合于人HepG2细胞膜表面,正常肝脏L02细胞及人乳腺癌细胞膜表面并没有超声微泡的聚集。结论:所制备的靶向超声微泡在体外研究中可实现特异性识别HepG2细胞作用,为进一步体内试验夯实了基础。第三部分载HSV-TK基因靶向超声微泡的制备目的:制备一种同时链接有GPC3单克隆抗体和HSV-TK基因的超声微泡。方法:1.将多聚赖氨酸与HSV-TK基因按一定比例混合反应后再加入一定量的超声微泡,实现微泡和HSV-TK基因的结合,加入PI标记质粒在激光共聚焦显微镜下观察载基因微泡的形态。2.在靶向超声微泡的基础上链接HSV-TK基因,制备载HSV-TK基因的靶向超声微泡,并在激光共聚焦显微镜下观察靶向微泡的形态。结果:1.载HSV-TK基因超声微泡经PI标记后在激光共聚焦显微镜下观察,于绿光激发波下可见微泡中心为黑色,周围有一圈红色的荧光,即表明HSV-TK基因已经特异性结合于微泡表面。2.经标记的载HSV-TK自杀基因的靶向超声微泡在激光共聚焦显微镜下观察,可见在蓝光激发波下微泡周围有一圈绿色的荧光,在绿光激发波下微泡周围有一圈红色的荧光,激光共聚焦处理下绿色荧光和红色荧光完全重合,形成黄色荧光,微泡表面同时链接有GPC3抗体和HSV-TK自杀基因。结论:成功制备了载HSV-TK自杀基因的靶向超声微泡,为进一步完成体外基因转染及体内试验建立了实验基础。
其他文献
农村城镇化步伐的加快,务工子女留守、单亲家庭学生的增加,家庭教育的缺失,或因家长文化程度偏低、溺爱型、粗暴型家庭教育方式占主导地位,使学校对学生的教育难度倍增,学生
进入21世纪以来,随着计算机技术的飞速发展,计算机已经成为人们日常生活、学习、工作中不可或缺的工具,信息技术课程越来越受到学校的重视。本研究通过问卷调查和实际访谈,对
以莱钢集团粉末冶金有限公司LAP100.29水雾化铁粉为原料,在900℃下进行高温氢气还原,研究高温还原处理对水雾化铁粉的显微硬度、化学成分、松装密度、流动性、压缩性等性质的
<正>本工程为非预应力钢结构,位于钢筋混凝土走廊与筛分楼煤仓之间。桁架两端分别支承在两个建筑物柱子的牛腿上,支座离地面高度约为20及28米。过去对此类结构的吊装一般都采
:《孟子》的应用使许多词语有了新的活力;后人根据《孟子》的应用,对词语加以凝固组合,于是在汉语文学语言里出现了许多新词新语;加之格言、成语、典故、俗语的凝练、应用,丰富了汉
通过采用导管架扣片建造技术建造文昌导管架的实例,系统介绍了该工艺方法的流程和特点。并且与传统的旋转立片建造技术进行对比,突出了新的建造方法在场地与设备使用以及建造安
云峰工程的隧洞进水口,由于开挖的跨度和高度比較大,岩石又不甚完整,洞頂部分有斜交洞軸的断层通过,并将頂板岩石切成不稳定的楔形体,考虑到施工安全,故选定先衬砌頂板的方
早产儿深部真菌感染是新生儿重症监护室早产儿常见的感染性疾病,由于早产儿自身免疫功能低下、广谱抗生素的使用、长时间肠外静脉营养以及侵入性操作等,使早产儿易发生深部真
随着海洋石油工业的不断发展进步,用于海洋石油开发的海洋工程结构物不但尺度不断增大而且复杂程度不断提高,再鉴于深水结构物对动力响应的敏感性,在结构物的建造中对精度标
由于中美两国不同的历史背景与文化环境,两国人民在价值观与思维方式等方面存在着巨大差异,这必定会对两国之间的贸易往来造成不利影响。中美两国之间的文化差异影响着中美贸