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第一部分:靶向脂质超声微泡的制备目的:制备一种脂质超声微泡作为载体,使其粒径为纳米级,并实现其与肝癌细胞特异性抗体的偶联。方法:1.将DPPA、Bio-DSPE按一定摩尔比溶解于有机溶液中,待有机溶液挥发后,形成白色粉末样物质,取出一定量的混合物,加入甘油、PBS缓冲液,45℃水浴后注入C3F8气体采用机械震荡法即可制备出超声微泡。将制备好的超声微泡光镜下观察其形态,粒径仪测定其粒径大小及表面所带zata电位。2.将制备出的超声微泡通过生物素-亲和素系统实现其与抗体的偶联,即在已制备的超声微泡中加入过量的链霉亲和素,再加入生物素化GPC3单克隆抗体即可。加入FITC标记的二抗在激光共聚焦显微镜下观察靶向微泡的形态,流式细胞仪检测标记上抗体的微泡比率。结果:1.制备出的超声微泡成圆形,大小较均一,平均粒径在528nm左右,所带平均电荷为-22mv。2.靶向超声微泡在免疫荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察,于蓝光激发波下可见微泡中心为黑色,周围有一圈绿色的荧光,表明GPC3单克隆抗体已经特异性结合于微泡表面,经流式细胞仪检测约85%的超声微泡标记上抗体。本课题授国家自然科学基金面上项目支持(NO:81272570)结论:1.制备出的超声微泡呈圆形、大小较均一,稳定性较好,其粒径为纳米级,满足本次实验要求。2.通过生物素-亲和素系统实现了超声微泡与GPC3单克隆抗体的偶联,为靶向识别及后续研究提供基础。第二部分肝癌细胞体外寻靶实验目的:实现连接有GPC3单克隆抗体的超声微泡(即靶向超声微泡)与人肝癌HepG2细胞特异性结合。方法:1.分别培养人肝癌HepG2细胞株、人肝脏L02细胞株,细胞免疫组化实验,检测证实肝细胞型肝癌(HCC)细胞膜表面有特异性GPC3抗原的表达。2.将人肝癌HepG2细胞株、人正常肝脏L02细胞株、人乳腺癌细胞株MCF-7经DiI染色,于激光共聚焦培养皿中加入经FITC标记二抗后的靶向超声微泡,待其充分结合后通过激光共聚焦显微镜检测其靶向性。结果:1.人肝癌细胞膜表面有抗GPC3特异性抗原表达,而正常肝脏L02细胞表面并没有表达。2.靶向超声微泡能特异性结合于人HepG2细胞膜表面,正常肝脏L02细胞及人乳腺癌细胞膜表面并没有超声微泡的聚集。结论:所制备的靶向超声微泡在体外研究中可实现特异性识别HepG2细胞作用,为进一步体内试验夯实了基础。第三部分载HSV-TK基因靶向超声微泡的制备目的:制备一种同时链接有GPC3单克隆抗体和HSV-TK基因的超声微泡。方法:1.将多聚赖氨酸与HSV-TK基因按一定比例混合反应后再加入一定量的超声微泡,实现微泡和HSV-TK基因的结合,加入PI标记质粒在激光共聚焦显微镜下观察载基因微泡的形态。2.在靶向超声微泡的基础上链接HSV-TK基因,制备载HSV-TK基因的靶向超声微泡,并在激光共聚焦显微镜下观察靶向微泡的形态。结果:1.载HSV-TK基因超声微泡经PI标记后在激光共聚焦显微镜下观察,于绿光激发波下可见微泡中心为黑色,周围有一圈红色的荧光,即表明HSV-TK基因已经特异性结合于微泡表面。2.经标记的载HSV-TK自杀基因的靶向超声微泡在激光共聚焦显微镜下观察,可见在蓝光激发波下微泡周围有一圈绿色的荧光,在绿光激发波下微泡周围有一圈红色的荧光,激光共聚焦处理下绿色荧光和红色荧光完全重合,形成黄色荧光,微泡表面同时链接有GPC3抗体和HSV-TK自杀基因。结论:成功制备了载HSV-TK自杀基因的靶向超声微泡,为进一步完成体外基因转染及体内试验建立了实验基础。