一个甘蓝型油菜A09区段的基因克隆及序列分析

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甘蓝型油菜突变体是油菜功能基因组分析的重要材料。本文通过对突变体和野生型A09标记区段8个矮杆候选基因的克隆及序列分析,明确了候选基因在两个材料之间的序列差异,分析了它们的序列特征和表达模式,并对部分基因构建过表达及干扰载体,转化油菜,获得了转化体。主要结果如下:1.生长素响应因子基因(ARF):ARF是一种转录因子,它可以和启动子区域内的生长素响应元件结合,促进或抑制基因的表达,从而影响植株生长发育,可能导致油菜变矮。①该基因从两个材料的GDNA中克隆得到,该基因与拟南芥ARF class 1的进化关系最近;序列中均包含12个内含子和13个外显子,内含子上存在1个碱基的差异,外显子上存在2个碱基的差异,氨基酸序列也有两个残基差异;两个基因均编码540个氨基酸残基序列,含三个保守结构域,两个突变位点分别在基因的B3-DNA binding和AUXIN-IAA结构域上,可能会影响基因功能。②表达分析表明,该基因在野生型茎中的表达量极显著高于突变体,突变体7天根和下胚轴中的表达量极显著高于野生型,子叶中的表达量也是显著高于野生型,其它组织没有明显差异。2.磺基转移酶基因(ST):本研究从突变体和野生型的cDNA中克隆了三个BnST基因,它们属于磺基转移酶基因家族,都具有sulfotransferase-1结构域,并且它们在两个材料的保守结构域上均存在序列差异,可能导致植株变矮。1)BnaA 09g53490D基因:(①该基因在两个材料中的开放阅读框(ORF)都是972 bp,编码323个氨基酸,但是在基因的ST1结构域上存在30个氨基酸残基的差异,并且在基因的 5’-phosphosulfate(5’PSB)和 3’-phosphoadenosine(3’PB)上,各存在一个氨基酸位点的差异。②表达分析表明,该基因在两个材料各个组织均有表达,在野生型7天根中的表达量极显著高于突变体,花中的表达量也是显著高于突变体,突变体茎中的表达量显著高于野生型,其它组织没有明显差异。③构建了该基因在两个材料中的过表达及干扰载体,利用农杆菌介导的花侵染法转入油菜,获得10株在突变体中过表达该基因的T0代植株。2)BnaC09g52480D基因:①该基因在两个材料中开放阅读框(ORF)都是978 bp,编码325个氨基酸,但是在基因的ST1结构域上存在32个氨基酸残基的差异,并且在基因的3’PB上存在一个氨基酸位点的差异。②表达分析表明,该基因在野生型花和蕾中的表达量极显著高于突变体,子叶中的表达量也是显著高于突变体,突变体茎中的表达量显著高于野生型,其它组织没有明显差异。③构建了该基因在两个材料基因的过表达载体。3)BnaA09g53480D基因:①该基因在两个材料中开放阅读框(ORF)都是807 bp,编码268个氨基酸,但是在基因的ST1结构域上存在29个氨基酸残基的差异,并且在基因的5’PSB上存在一个氨基酸位点的差异。②表达分析表明,该基因在突变体花中的表达量极显著高于野生型,茎和角果中的表达量也是显著高于野生型,其它组织没有明显差异。③构建了该基因在两个材料基因的过表达载体,利用农杆菌介导的花侵染法转入油菜,筛选获得了 8棵T0代阳性株。4)BnaAnng13870D基因:①该基因从两个材料基因组DNA中克隆得到,在两个材料中均包含7个内含子和8个外显子,内含子上存在113个碱基差异,外显子上存在6个碱基差异,基因氨基酸序列间有两个氨基酸残基差异,但是它们均编码589个氨基酸,含有两个保守结构域,保守结构域上没有差异。②表达分析表明,该基因在两个材料7天根中的表达量极显著高于其它组织,其中野生型7天根中的表达量极显著高于突变体,茎和花中的表达量也是显著高于突变体,其它组织没有明显差异。3.本文还克隆了核苷酸糖运转蛋白基因(NSTs)、根生长因子基因(RGF)及18S核糖体预组装gar相关蛋白基因,但是它们的基因组序列在两个材料中均不存在差异,可能跟株高性状没有关系。
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