奶牛乳腺炎是导致奶牛养殖业经济损失的重要疾病之一,部分致病菌可导致人兽共患病或者引发食物中毒,对人类健康构成威胁。其中,肺炎克雷伯菌是导致奶牛乳腺炎的条件性致病菌,也是常见的人兽共患病病原菌。该研究对规模化牧场的奶牛乳腺炎致病菌进行分离鉴定,并对分离的肺炎克雷伯菌致病力和耐药性进行分析,建立大鼠肺炎克雷伯菌乳腺炎模型,为奶牛乳腺炎的防控及耐药问题提供理论基础和实践指导。结果发现:(1)规模化牧场奶牛乳腺炎病原菌分离鉴定试验收集福建、江苏、广东、河北、安徽、山西、内蒙古和浙江地区11个规模化牧场乳腺炎奶样856份,进行细菌分离培养和鉴定。结果显示:乳腺炎样品的细菌检出率为84.46%;乳腺炎分离菌以环境性致病菌为主,主要为大肠杆菌(22.74%)、肺炎克雷伯菌(14.55%)和阴沟肠杆菌(9.05%)等,另外也分离到了传染性乳腺炎致病菌,如金黄色葡萄球菌(4.25%)和无乳链球菌(1.71%),且不同地区的乳腺炎致病菌分离情况具有地区差异性。该结果显示,乳腺炎致病菌随着现代化养殖的不断规范,环境性致病菌的危害日益突出。(2)119株致乳腺炎肺炎克雷伯菌的毒力基因和生物膜形成能力检测及耐药性分析对分离的1 19株肺炎克雷伯菌,采用PCR检测菌株毒力相关基因携带情况,检测体外生物膜形成能力,并进行药敏试验和检测产ESBL的菌株13种β-内酰胺酶基因携带情况。结果显示:119株肺炎克雷伯菌中,检出magA、wcaG、rmpA、wabG、fimH、uge、Aerobactin、ybtA 和 ureA 共 9 种毒力基因,IucB、kfuBC和allS 基因未检测出;其中,生物膜阳性株为103株;119株肺炎克雷伯菌对氨苄西林耐药率最高,耐药率为94.96%,对部分头孢类和氨基糖苷类也产生耐药性;但药敏显示,119株肺炎克雷伯菌对卡那霉素最敏感,敏感率为97.48%。产ESBLs肺炎克雷伯菌共28株,检测出β-内酰胺酶基因TEM、SHV、OXA-1和CTX-M group1的阳性菌分别为19、22、2、19株,其他耐药基因未检出。产ESBLs菌株耐药率较非产ESBLs菌株耐药率高。结果表明:规模化牧场分离的肺炎克雷伯菌主要毒力基因携带率较高,部分分离菌具有高致病力。生物膜的高阳性率,更容易产生多重耐药性,某些菌株同时携带多种β-内酰胺酶基因,故肺炎克雷伯菌的多重耐药性应引起牧场关注和防范。(3)大鼠肺炎克雷伯菌乳腺炎模型的建立与致病力研究泌乳4 d的母鼠作为实验动物,在第四对乳腺分别注入100μL肺炎克雷伯菌1×109cfu/mL细菌悬液。分别在注菌后6h、12 h和24 h收集血液和乳腺样本,观察临床症状和大体解剖,检测血常规、乳腺病理组织学变化和相关炎性基因的表达。结果显示:试验组母鼠精神沉郁,乳区肿胀,乳腺组织水肿充血严重并出现乳凝块;与对照组相比,WBC数极显著降低(p<0.01)。组织病理学观察显示,试验组腺泡内出现大量炎性细胞,部分上皮细胞脱落。荧光定量PCR检测发现,与对照组相比,试验组乳腺组织IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、TLR-4和NOD2的基因表达水平均极显著升高(p<0.01)。故试验成功建立肺炎克雷伯菌大鼠乳腺炎模型,且肺炎克雷伯菌能促进相关炎性因子的释放,导致乳腺的损伤。综上所述,规模化牧场引起乳腺炎的主要致病菌以条件性致病菌为主,主要为大肠杆菌和肺炎克雷伯菌,且肺炎克雷伯菌部分菌具有多重耐药性,需要引起牧场的高度重视。肺炎克雷伯菌感染大鼠乳腺炎,导致腺泡内大量炎性细胞游出,部分乳腺上皮细胞受损,且该菌可以促进相关炎性因子的释放,引起乳腺炎症。该研究为我国乳腺炎的防控提供调查研究材料和基础理论研究指导。