论文部分内容阅读
大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)是研究得最为广泛的模式菌,按照致病性特点,可以分为共生型E. coli、肠内致病性E. coli (Intraintestinal pathogenic E. coli, InPEC)和肠外致病性E. coli (Extraintestinal pathogenic E. coli, ExPEC)。ExPEC有一些特异的毒力特点能使其定殖并侵袭宿主肠外组织,引发一系列感染,如尿道感染、脑膜炎、败血症、呼吸道感染、肺炎、心内膜炎和骨髓炎等。近几年来,猪群疫病的多发和易发,成为阻碍我国养猪业发展的主要因素。本实验室2004年以来从全国发病猪场内患病猪肠外组织中分离了1000多株E. coli,经过进一步流行病学分析,结果显示,猪源ExPEC已严重威胁到我国养猪业的发展。但是目前国内外针对ExPEC类菌株的研究主要集中于人源和禽源ExPEC,对于猪源ExPEC感染不够重视,对该类致病菌的研究报道非常少。并且目前也没有猪源ExPEC完整的全基因组序列问世。此外,E. coli的血清型众多,且分离出的猪源ExPEC菌株常伴有高耐药性,给猪源ExPEC感染的防控带来了挑战。因此,本实验室利用第二代测序技术首次得到了猪源ExPEC强弱毒株的完整全基因组序列,分析了其毒力因子,研究其生物学特性并阐述其强致病性的原因。此外,选择了两个保守的外膜蛋白OmpC和OmpF,作为猪源ExPEC感染的候选亚单位疫苗进行研究分析。具体研究内容包括：1.猪源ExPEC强毒株PCN033和弱毒株PCN061全基因组测序及分析从本实验室临床分离的猪源ExPEC菌株中,以小鼠为模型,筛选出强毒株PCN033和弱毒株PCN061,采用第二代测序技术454测序,在国际上首次得到猪源ExPEC全基因组序列。完成测序的PCN033基因组由一个长度为4,987,958bp的染色体和三个长度分别为3,319bp,4,086bp和161,511bp的质粒组成；PCN061基因组由一个长度为4,603,777bp的染色体和六个长度分别为2,014bp,5,754bp,6,222bp,34,692bp,103,644bp和145,722bp的质粒组成。我们对PCN033和PCN061基因组进行了较为详尽的基因注释,系统的对基因功能进行分类和比较,预测假基因,分析基因组基本元件,包括基因组岛、前噬菌体区域和插入序列等。将PCN033、PCN061和共生型E. coli HS基因组所编码的蛋白质序列进行BLASTP (?)(?)对,其中强毒株PCN033特异的编码序列有1056个。依据所选取的56株埃希氏菌中所拥有的325个核心基因,构建进化树,结果显示PCN033和PCN061菌株在大肠杆菌中的进化位置分别跟InPEC UMN042和共生型HS菌株最近。2.强弱毒株的比较基因组学分析通过比较PCN033和PCN061的基因序列,发现PCN033特异的序列主要是水平转移DNAs,其中前噬菌体区域约占50%。在这些特异性的序列中,还包括许多编码毒力因子的相关基因,如黏附素、脂多糖、荚膜多糖、铁离子摄取与转运系统、分泌系统以及与代谢有关的基因。此外,PCN033菌株含有一个潜在的毒力质粒PCN033p3,该质粒含有许多典型的ExPEC毒力因子。我们将两株菌株在以上几个方面的差异进行了具体的分析,归纳总结了这两株菌毒力差异的基因型基础。3.强弱毒株生物学特性的比较分析我们以BALB/c小鼠为模型,测定了强弱毒株的LD50分别为3.4×105和2.3×107CFU g-1,并且强毒株PCN033在小鼠血液中的繁殖能力显著强于弱毒株PCN061。此外,感染PCN033菌株的小鼠脑组织的病理切片显示出明显的脑膜炎病变。依据上述分析的基因型差异结果,我们鉴证了相应的生物表型差异,包括鞭毛、运动性、生物被膜以及代谢能力。结果显示,强毒株相比于弱毒株,能够形成周身鞭毛,具有较强的运动性,形成生物被膜的能力较弱,能够代谢较多的糖类,如蔗糖和棉籽糖。强弱毒株生物学特性的比较分析,从生物表型方面解释了其毒力差异的原因。4. ExPEC外膜蛋白OmpC和OmpF免疫原性的研究本实验室挑选了猪源ExPEC中两个保守的外膜蛋白OmpC和OmpF,进行克隆和原核表达来分析其免疫原性。纯化的重组蛋白OmpC和OmpF在腹腔免疫小鼠后,产生了较强的免疫球蛋白(immunoglobulin G, IgG)抗体反应,包括IgG1和IgG2a亚类,其中诱导的IgG1水平较高。免疫了OmpC和OmpF的小鼠,在感染了2.5×107CFU (5×LD50)强毒株ExPEC PCN033后,保护率分别达到了62.5%和87.5%。此外,抗OmpC和抗OmpF的血清均能调节补体依赖性的调理吞噬。进化分析的结果显示,基因ompC广泛的存在于所有研究的E. coli菌株中,而基因ompF在部分E. coli菌株中发生了突变。进一步的选择分析显示,基因ompC可能承受强免疫压力。我们的实验和进化分析结果显示,OmpC可能成为猪源ExPEC感染的候选疫苗。