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研究目的：抗磷脂抗体(antiphospholipid antibodies, aPL)／抗p2糖蛋白Ⅰ抗体(anti-β2-glycoprotein I, anti-β2GPI)在抗磷脂综合症(antiphospholipid syndrome, APS)发病机带中扮演重要角色。它们可以激活细胞内信号通路,诱导促血栓、促炎症因子的表达,最终导致血栓发生。体外细胞模型表明跨膜蛋白Toll样受体4 (Toll-like receptor 4, TLR4)作为一个重要分子参与aPL/anti-β2GPI对靶细胞的识别,但目前仍缺乏足够的体内实验结果支撑。本论文旨在前期研究基础上,利用纯系TLR4正常(C3H/HeN)及TLR4缺陷型(C3H/HeJ)小鼠建立实验性APS (EAPS)小鼠模型,深入分析TLR4在aPL/anti-β2GPI诱发小鼠动静脉血栓形成中的作用,为APS的免疫干预及血栓形成的防治提供实验依据。研究方法：(1)应用Fmoc法化学合成β2GPI N端35-51位氨基酸的多肽,与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联后免疫新西兰大白兔制备抗血清,蛋白G纯化得到针对β2GPI第1结构域的表位特异性抗β2GPI抗体(以下简称anti-β2GPI),并鉴定抗体的特异性及致病性。(2)分离C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠腹腔巨噬细胞于体外培养,运用RT-qPCR检测anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导的巨噬细胞TF、TNF-α、IL1β和IL6 mRNA表达,Western blot方法检测细胞培养上清中TF、TNF-α、IL1β和IL6蛋白表达,观察TLR4在anti-β2GPI/β2GPI诱导巨噬细胞表达TF和炎症因子中的作用。(3)建立EAPS小鼠模型,分别于0 h和48 h对C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠腹腔注射anti-β2GPI (100 μg/每只)或APS病人来源的IgG-APS (500 μg/每只),72 h后用于实验。取两种小鼠腹腔巨噬细胞和双侧颈动脉,超声裂解,Xa生成法检测TF活性,免疫组化检测股动脉内皮细胞TF表达,免疫荧光检查巨噬细胞表面TF、TNF-α、IL1α和IL6蛋白表达,进一步分析TLR4缺陷对TF和炎症因子表达的影响。(4)取EAPS小鼠胸主动脉,运用RT-qPCR和Western blot方法分别检测血管壁VCAM-1、ICAM-1和E-selectin的mRNA和蛋白的表达,从而分析TLR4对anti-β2GPI和IgG-APS诱导粘附分子表达的影响。(5) C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠腹腔注射anti-β2GPI (100 μg/每只)建立EAPS小鼠模型,用含浓度3.5%FeCl3的滤纸条外敷颈动脉和股静脉诱导血栓形成,HE染色观察血栓大小。FeCl3外敷颈动脉前,尾静脉注射CF633标记的抗血小板CD41 Fab片段(0.25μg/每只),荧光显微镜观察颈动脉血栓大小。研究结果：(1)所制备的anti-β2GPI具有表位特异性,可识别人源和鼠源β2GPI分子,能与位于β2GPI第1结构域的隐蔽抗原表位特异性结合且具有致病效应。(2)体外培养的C3H/HeN小鼠腹腔巨噬细胞经anti-(β2GPI/β2GPI复合物刺激后]TF、TNF-α、IL1β和IL6 mRNA和蛋白表达明显升高,与C3H/HeJ小鼠相比差异显著。(3)在EAPS模型小鼠中,C3H/HeN小鼠的巨噬细胞和颈动脉TF活性明显升高,巨噬细胞和内皮细胞TF蛋白表达显著增多,巨噬细胞表面TNF-α、IL1β和IL6蛋白表达增加,与C3H/HeJ小鼠组相比差异显著。(4) C3H/HeN小鼠腹腔注射anti-β2GPI或IgG-APS后,胸主动脉粘附分子VCAM-1、ICAM-1和E-selectin mRNA和蛋白表达升高,与相同处理的C3H/HeJ小鼠相比差异显著。(5)在FeCl3诱导EAPS小鼠血栓模型中,与C3H/HeJ小鼠组相比,C3H/HeN小鼠颈动脉产生更大的血栓,股静脉有更多的红细胞堆积。结论：(1)TLR4介导抗β2GPI抗体/β2GPI抗原(anti-β2GPI/β2GPI)复合物激活体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞表达TF、TNF-α、IL1β和IL6,同时参与anti-β2GPI或IgG-APS诱导的EAPS模型小鼠TF和炎症因子表达,表明TLR4在aPL诱导的促血栓、促炎症状态中发挥重要作用。(2)TLR4参与EAPS模型小鼠胸主动脉粘附分子VCAM-1、 ICAM-1和E-selectin表达,表明TLR4在anti-β2GPI或IgG-APS诱导的内皮细胞促粘附状态中扮演重要角色。(3)TLR4介导anti-p2GPI诱导的EAPS模型小鼠动脉血栓形成,同时在anti-p2GPI诱导的静脉血栓形成发挥重要作用,为APS血栓形成的预防及治疗提供新的思路。