Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是机体识别微生物感染、触发宿主天然免疫反应以发挥抗感染作用的关键分子，同时对获得性免疫反应也具有调控作用。TLR家族成员能够识别不同的病原相关分子模式（pathogen-associated molecule patterns,PAMPs）。其中，TLR9特异性识别病原微生物的CpG基序，启动炎症反应，并且能够促进Th1型免疫反应。机体的炎症反应有助于清除入侵的病原体，但是过度或长期的炎症反应则会对机体造成伤害，导致自身免疫性疾病甚至肿瘤的发生。因此，炎症反应的强度与持续时间必须受到精细的调控。炎症反应的负向调控机制研究一直是天然免疫领域研究的热点。　　丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶38（Serine/threonine kinase38,Stk38）是NDR/LATS（nuclear Dbf2p-related kinase,NDR）蛋白激酶家族的成员之一，在进化中高度保守。Stk38能够促进Fas诱导的细胞凋亡。Stk38缺失小鼠易患T细胞淋巴瘤。Stk38还能够稳定c-myc和防止p21蛋白的积聚，从而促进细胞周期中G1期进程。然而，Stk38在免疫反应中的作用目前尚不清楚。本文则主要研究了Stk38对巨噬细胞中TLR9信号通路的调控作用及其相关的分子机制。　　为了研究蛋白激酶Stk38在天然免疫反应中的作用，利用小干扰RNA在小鼠原代腹腔巨噬细胞中敲低Stk38的表达，然后给予不同的TLRs配体刺激，通过实时荧光定量PCR的方法检测TNF-α、IL-6等细胞因子的表达，发现干扰组中CpG诱导的IL-6的表达水平明显高于对照组细胞。　　在RAW264.7细胞中转染表达靶向Stk38的shRNA的质粒建立稳定敲低Stk38的细胞株。使用LPS、LTA和CpG刺激稳筛RAW264.7细胞株，发现稳定敲低组细胞CpG诱导的IL-6的释放明显高于对照组细胞。实时荧光定量PCR的结果也显示稳定敲低组细胞中CpG诱导的TNF-α及IL-6的mRNA的转录水平明显高于对照细胞。以上结果表明，Stk38能够抑制巨噬细胞中CpG诱导的TNF-α及IL-6的转录，负向调控TLR9介导的炎症反应。　　进一步验证Stk38对TLR9介导炎症反应的负向调控作用，采取Stk38基因缺陷型小鼠进行后续研究。使用大肠杆菌感染Stk38基因敲除小鼠，发现Stk38缺失之后，小鼠血清中TNF-α与IL-6的水平明显高于野生型小鼠，生存期亦缩短。使用不同的TLRs配体刺激腹腔巨噬细胞，在Stk38缺陷的巨噬细胞中，CpG诱导的TNF-α与IL-6明显升高，而对LPS、LTA诱导的炎症因子没有显著影响。在Stk38缺陷的小鼠中，盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture,CLP）诱导的脓毒症发病加重，死亡率升高。通过腹腔注射CpG ODN直接刺激小鼠，ELISA方法检测小鼠体内血清中促炎因子的水平。发现Stk38缺陷组小鼠血清中的TNF-α和IL-6水平显著高于野生型小鼠。这些结果表明Stk38是TLR9介导的炎症反应中的一个重要的负向调控分子。进一步检测了Stk38缺失对CpG诱导的信号通路活化的影响，发现Stk38缺失之后，CpG诱导的ERK1/2的活化明显增强，而对MAPKs其他信号通路及NF-κB的活化没有显著影响。双荧光素酶报告基因检测实验的结果也证明Stk38能够抑制MyD88诱导的Elk1的活化。说明Stk38是通过抑制ERK1/2的活化负向调控CpG诱导的炎症反应的。　　MAP3K家族是MyD88和TRIF下游重要的信号分子，在不同的TLRs信号通路中发挥重要作用。TAK1（MAP3K7）介导NF-κB的活化；Tpl2能够激活ERK1/2；MEKK1促进JNK的活化，但抑制ERK1/2的活化；ASK1对于TLR4介导的p38激活至关重要。MEKK3的缺失则显著抑制TLR4介导的炎症反应。有证据提示MEKK2参与TLRs信号转导，但其在TLRs介导的天然免疫反应中的确切作用还需要进一步研究。利用小干扰RNA敲低巨噬细胞中MEKK2的表达，发现CpG诱导的ERK1/2的活化受到明显抑制，TNF-α、IL-6的分泌也显著降低。双荧光素酶报告基因检测实验的结果也证明MEKK2能够明显促进MyD88诱导的Elk1的活化。综上，MEKK2是TLR9介导ERK1/2活化过程中重要的信号分子。　　为了进一步研究Stk38在MEKK2依赖的ERK1/2活化中的作用，采用双荧光素酶报告基因检测实验证明Stk38能够显著抑制MEKK2介导的Elk1的活化。在HEK293T细胞中共转染Stk38与MEKK2，发现Stk38能够以剂量依赖的方式抑制MEKK2的表达水平，并且这一效应不依赖于Stk38的激酶活性。在Stk38缺陷的小鼠原代腹腔巨噬细胞中，MEKK2的表达水平也明显高于野生型小鼠。通过构建Stk38的不同缺失突变体，发现Stk38的羧基端及氨基端序列对其抑制MEKK2的表达是必需的。　　文献报道E3泛素连接酶Smurf1能够通过介导MEKK2的K48位多聚泛素化，进而促进其降解。在HEK293T细胞中共表达Stk38、Smurf1及MEKK2，发现Stk38能够与Smurf1协同作用，促进MEKK2的降解达。在HEK293T细胞中共表达Stk38、Smurf1、MEKK2及Ub，检测MEKK2的泛素化水平。实验结果表明，Stk38能够促进Smurf1介导的MEKK2的K48位多聚泛素化。利用重组蛋白进行的体外泛素化实验也得到了一致的结果。免疫共沉淀的实验结果发现Stk38能够组成性地与Smurf1结合，并且在CpG刺激之后，两者之间的结合增加。重组蛋白pull-down实验显示Smurf1与Stk38之间是直接结合。以上结果显示Stk38是通过促进Smurf1介导的MEKK2的K48位多聚泛素化及降解，从而抑制其表达水平，抑制CpG诱导的ERK1/2的活化。　　进一步探讨了Stk38如何促进Smurf1泛素化MEKK2。与许多E3泛素连接酶类似，Smurf1的泛素连接酶活性也受自身泛素化水平的调控。利用质粒共转染及体内泛素化实验，证明Stk38能够促进Smurf1自身的泛素化水平。为进一步证明Smurf1是否参与调控TLR9信号通路，利用小干扰RNA敲低巨噬细胞中Smurf1的表达，发现CpG诱导的TNF-α、IL-6的表达水平显著增高。结果表明Smurf1能够负向调控TLR9信号通路的活化。　　综上所述，本次研究证明MEKK2是TLR9信号通路中ERK1/2活化的关键分子，Stk38通过与Smurf1相互作用，促进Smurf1的自身泛素化，增强其E3泛素连接酶活性，进而促进Smurf1介导的MEKK2的K48位多聚泛素化及降解，最终实现对TLR9介导的炎症反应的负向调控作用。Stk38的缺失会导致小鼠对E.coli感染及CLP诱导的脓毒症更加易感。这些结果都表明Stk38是巨噬细胞中TLR9介导的炎症反应中一个重要的负向调控分子，这将有助于更好地了解机体炎症反应的精细调控机制及自身免疫性疾病的复杂发病机理，同时对寻找治疗炎性及自身免疫性疾病的治疗靶点也具有提示意义。