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目前，农林业广泛使用的有机磷农药对海洋生物危害巨大，已经对海水养殖业形成威胁。为了控制海水有机磷农药的污染程度，减少渔业损失，我国现行的《海水水质标准（GB 3097-1997）》和《渔业水质标准（GB 11607-89）》都对水体中马拉硫磷、甲基对硫磷等有机磷农药的浓度作了严格限定。然而，仅有标准还不足以有效控制有机磷农药的污染水平，重要的是对有机磷农药进行快速灵敏的监测。近年来，人们更多地把注意力集中到具有高选择性、高灵敏度、较好的稳定性、低成本、能在复杂的体系中进行快速在线连续监测的生物传感器上。 生态毒理学研究表明，有机磷农药的毒性作用主要归因于对动物乙酰胆碱酯酶[acetylcholinesterase，AChE（EC 3.1.1.7）]的抑制，而且在一定条件下，AChE的活性变化与有机磷农药的浓度存在良好的相关性。这正是制作AChE酶传感器监测有机磷农药的理论基础。此外，已经知道不同生物来源的AChE对有机磷农药具有不同的敏感性，因此，为了灵敏监测海水中微量有机磷农药，有必要对不同生物来源的AChE进行筛选。鱼类被认为是水生生态系统中对有机磷农药较为敏感的一类动物。目前，已有许多报道采用鱼脑AChE作为检测水体有机磷农药污染程度的指示酶。同时，鉴于海水高盐度的特性，生物传感器应以海洋动物的AChE为酶源。所以，本文以10种海洋鱼类：鲈鱼（Lateolabrax japonicus）、黄鱼（Hexagrammos otakii,）、美国红鱼（Sciaenops ocellatus）、真鲷（Pagrosomus major）、黑鲷（Sparus macrocephalus）、鲅鱼[Scomberomorus niphonius（Curier）]、面包鱼[Navodon septentrionalis（G ü nther）]、鳗鲡[Anguilla japonica（Temminck et Schlegel）]、黑头鱼[Sebastodes fuscescens（Houttuyn）]和黄花鱼[Pseudosciaena polyactis（Bleeker）]为实验材料，采用半抑制浓度(IC50)和双分子速率常数（Ki）为指标，通过体外抑制作用比较了这10种海鱼脑AChE对马拉硫磷和甲基对硫磷的敏感性。实验发现：这10种海鱼的脑组织AChE的基础活性在4.62～35.65μmol／min／g之间，面包鱼的酶活性最高，黄花鱼的酶活性最低。对马拉硫磷，由IC50所得到的AChE敏感性为：鲅鱼、黄鱼、鲈鱼、真鲷＞黑鲷＞黑头鱼、鳗鲡＞美国红鱼、黄花鱼＞面包鱼；由Ki所得到的AChE敏感性为：鲅鱼＞黄鱼、鲈鱼、真鲷＞黑鲷、黑头鱼、鳗鲡＞美国红鱼、黄花鱼、面包鱼。对甲基对硫磷，由IC50所得到的AChE敏感性为：鲅鱼＞鲈鱼＞黄鱼、黄花鱼、真鲷、黑鲷、黑头鱼、鳗鲡＞美国红鱼＞面包鱼；由Ki所得到的AChE敏感性为：鲅鱼＞鲈鱼、黄鱼、黄花鱼、黑鲷、黑头鱼、鳗鲡＞真鲷＞美国红鱼＞面包鱼。鲅鱼、鲈鱼和黄鱼对这两种有机磷农药都较为敏感。另外，鱼脑AChE活力的抑制作用与水体中的有机磷农药具有良好的剂量—效应关系。在1～50mg·L-1浓度范围内，两者间呈现较好的线中国海洋人学硕卜论文:监测海水有机磷农药的生物传感器研制—敏感酶的筛选、纯化，J固定技术研究性相关性，其相关系数基本上都在0.93以上。根据AChE的敏感性及其对有机磷农药的线性响应程度，黄鱼和妒鱼脑AChE分别适于作为监测马拉硫磷和甲基对硫磷的指示酶，而鱿鱼脑AChE对两种有机磷农药都适用。 在筛选得到敏感酶的基础上，采用亲和层析法对鱿鱼脑组织的AChE进行分离纯化，然后对其进行底物特异性、过量底物抑制效应和抑制剂选择性检验。结果证实该酶为AChE，其最大比活力为297.82林moL/min/mg，最佳pH范围在7.0一8.0之间，最佳温度为30℃。该酶经SDS一PAGE呈一条带，表明其纯度达电泳纯。在海水背景下，进一步探讨了纯化酶（游离状态）指示海水中有机磷农药微污染的可行性。实验表明，在抑制时间为20min时，马拉硫磷和甲基对硫磷对鱿鱼脑AChE的半抑制浓度分别为1 .26 X10一，mol·L一’（4 .1 54 mg·L一l）和o.50xlo一5m。比一’（l .168 mgL一’）。鱿鱼脑组织的AchE对马拉硫磷和甲基对硫磷均较为敏感。实验还发现，在一定浓度范围内，AChE活力对有机磷农药表现出显著的线性响应。这提示，跋鱼脑组织的AChE可以作为监测海水有机磷农药酶传感器的敏感材料。 制备酶传感器的关键技术是酶的固定化，它影响到酶活性的保持和传感器的稳定性。本研究首次以普鲁卡因胺（procainamide）为吸附剂、多孔琼脂珠为载体，制备固定化的跋鱼脑组织AChE。酶活力测试发现，该固定化酶具有很高的催化活力和较好的稳定性，酶活回收率达88%。PH稳定性和热稳定性的研究结果表明，经过固定后，酶的最佳PH值范围变化不大，但其最适温度范围变宽，热稳定性提高。以该固定化酶为识别元件，以PH电极为换能器，构建流动注射型乙酞胆碱醋酶传感器。该传感器具有良好的重现性（RSD=1 .427%，n=10），可实现对有机磷化合物的在线监测，对甲基对硫磷具有线性响应的浓度范围为4.29 x 10.’“-4.29 x 10一8 mol·L‘’（或0.1，g·L一‘一1009·L一’），最低检测限为l.3xlo一，omol·L.I（或0 .03 09·L一，）.