论文部分内容阅读
目的:藏羚羊和高原鼠兔是青藏高原的特有动物,生活在寒冷、低氧和高海拔地区,携带的微生物多是未知的。本课题旨在系统分析藏羚羊粪便和鼠兔肠内容物的可培养菌群,分离疑似新种,发现新的细菌,并探讨其可能的生物学意义。方法:1.在28℃和37℃两种温度下,普通和5%CO2气体环境下,采用脑心浸液含羊血培养基、TSA培养基、NA培养基等,根据菌落形态的多样性进行可培养菌群的分离培养与纯化。提取细菌分离株的基因组核酸,PCR扩增和Sanger测序获得16S rRNA基因序列。通过GenBank和EzTaxon数据库在线比对获得16S rRNA基因序列与已知菌种的相似性,完成菌株的初步鉴定。2.对鉴定结果为疑似新种的菌株,采用革兰氏染色、透射电镜、孔雀蓝染色、动力实验等进行细菌基本特征检测,基于16S rRNA和基因组序列进行系统进化树分析,采用糖发酵、酶活性、药敏实验等检测菌株的生理生化特征,采用反相高压液相色谱法、二维薄层色谱法、HITACHI L-8900高速氨基酸分析仪等检测菌株的菌体成分,采用基因注释和基因组杂交完成基因组分析。综合分析菌株表型、基因型和生化特征,确定菌株的分类学位置,并完成新种的命名和模式菌株的保藏工作。对分离的已知菌,进行多样性和医学意义分析。结果:1.本课题采用2种相同的培养条件,从鼠兔肠内容物成功鉴定到525株菌,隶属于3个细菌门、6个细菌纲、12个细菌目、20个细菌科、23个属、52个种;从藏羚羊粪便中,成功鉴定到734株菌,隶属于3个细菌门、4个细菌纲、9个细菌目、20个细菌科、28个属、73个种。采用22种培养条件,从青藏高原藏羚羊粪便中成功鉴定1977株菌,分布于4个细菌门、7个细菌纲、15个细菌目、30个细菌科、44个属、123个种。报道从临床患者中分离到的条件致病菌有23个种,包括中华不动杆菌、约翰逊放线菌、圆形芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、摩加夫芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌、脂黄素棒杆菌、海迪茨氏菌、Dietzia natronolimnaea、杜兰肠球菌、粪肠球菌、孟氏肠球菌、鹑鸡肠球菌、玫瑰考克氏菌、骚动厄氏菌、栖稻假单胞菌、科尼葡萄球菌、马胃葡萄球菌、华氏葡萄球菌、人葡萄球菌新霉素败血症亚种。从藏羚羊粪便中分离获得的优势种为柠檬节杆菌、木聚糖芽孢杆菌、屎肠球菌。2.从藏羚羊粪便中分离鉴定细菌新种7个,分别为菌株449T、194 T、2129 T、2251T、2183T、2184T、592T。经鉴定:（1）菌株449T为栖霉菌属的新种,命名为朱既明栖霉菌（Mycetocola zhujimingii）,是一种以anteiso-C15:0为主要脂肪酸,以MK-10和MK-11为主要呼吸醌,以二磷脂酰甘油和磷脂酰甘油为主要极性脂,以赖氨酸为诊断性氨基酸,与M.zhadangensis进化关系较近;（2）菌株194T为盐地杆菌属的新种,命名为洪涛盐地杆菌（Salinibacterium hongtaonis）,对NaCl呈高耐受性,以anteiso-C15:0和anteiso-C17:0为主要脂肪酸,以赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸为细胞壁主要氨基酸,以MK-11和MK-10为主要呼吸醌,以二磷脂酰甘油和磷脂酰甘油为主要极性脂,不能发酵D-甘露糖,且萘酚-AS-BI-磷酸水解酶活性阴性;（3）菌株2129T命名为李兰娟放线菌（Actinomyces lilanjuaniae）,以C18:1ω9c和C16:0为主要脂肪酸,以二磷脂酰甘油、糖脂、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇甘露糖苷和磷酸糖脂为主要极性脂,可以发酵D-己糖醇和D-木糖,但是不能发酵D-甘露糖和D-蜜二糖、酯酶（C4）和脯氨酸芳酰胺酶活性阴性,与A.dentalis和A.slackii进化关系较近;（4）菌株2251T命名为廖万清副球菌（Paracoccus liaowanqingii）,以C18:1ω7c为主要脂肪酸,以泛醌10为主要呼吸醌,以磷脂酰乙醇胺、二磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、磷脂、糖脂为主要极性脂,以meso-2,6-二氨基庚二酸、丙氨酸和谷氨酸为细胞壁肽聚糖氨基酸,分类学地位与P.gahaiensis进化关系较近;（5）菌株2183T和2184T分别命名为俞东征棒杆菌（Corynebacterium yudongzhengii）和梁国栋棒杆菌（Corynebacterium liangguodongii）,是两个硝酸盐还原反应阴性、α-胰凝乳蛋白酶和过氧化氢酶活性阳性、D-果糖和5-钾酮葡萄糖酸酵解阳性、D-乳糖酵解阴性的菌种,两株菌均以二磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和磷脂酰肌醇甘露糖苷为主要极性脂,以MK-8（H2）和MK-9（H2）为主要呼吸醌,肽聚糖中含有meso-2,6-二氨基庚二酸。进化关系上,俞东征棒杆菌与C.doosanense和C.tapiri近,梁国栋棒杆菌与C.lipophiloflavum和C.mycetoides近;（6）菌株592T命名为陈薇气微菌（Aeromicrobium chenweiae）,菌株可以发酵L-鼠李糖、D-木糖和D-纤维二糖,但无法还原硝酸盐,主要脂肪酸为C18:1ω9c和C18:010-methyl,主要极性脂为二磷脂酰甘油、磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇,主要呼吸醌为MK-9（H4）和MK-8（H4）,且细胞壁肽聚糖含有LL-二氨基庚二酸。3.从高原鼠兔肠内容物中分离鉴定细菌新种2个,分别为MF30-AT和MF47 T。经鉴定:（1）菌株MF-30AT命名为巴德年壤霉菌（Agromyces badenianii）,为需氧、革兰氏阳性菌,菌株在28℃、有氧、pH 7.0的TSA培养基上生长最佳,不能发酵熊果苷、D-果糖、D-蔗糖、糖原、水杨素和淀粉,β-葡萄糖苷酶活性为阴性;（2）菌株MF-30AT与陈薇气微菌不属于同一个种,被命名为严杰气微菌（Aeromicrobium yanjiei）,菌株可以发酵L-鼠李糖、D-木糖和D-纤维二糖,但无法还原硝酸盐,主要脂肪酸为C18:1ω9c和C18:08:0 10-methyl,主要极性脂为二磷脂酰甘油、磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇,主要呼吸醌为MK-9（H4）和MK-8（H4）,且细胞壁肽聚糖含有LL-二氨基庚二酸。结论:1.采用2种相同的培养条件,从鼠兔肠内容物成功鉴定到525株菌,隶属于3个细菌门、6个细菌纲、12个细菌目、20个细菌科、23个属、52个种;从藏羚羊粪便中,成功鉴定到734株菌,隶属于3个细菌门、4个细菌纲、9个细菌目、20个细菌科、28个属、73个种。采用22种培养条件,从藏羚羊粪便中成功分离到1977株菌,鉴定为4个门、7个纲、15个目、30个科、44个属和123个种,报道从临床患者样本中分离到的细菌种有23个。2我们发现和命名了九个细菌新种,分别是朱既明栖霉菌（Mycetocola zhujimingii）、洪涛盐地杆菌（Salinibacterium hongtaonis）、李兰娟放线菌（Actinomyces lilanjuaniae）、廖万清副球菌（Paracoccus liaowanqingii）、巴德年壤霉菌（Agromyces badenianii）、俞东征棒杆菌（Corynebacterium yudongzhengii）、梁国栋棒杆菌（Corynebacterium liangguodongii）、陈薇气微菌（Aeromicrobium chenweiae）和严杰气微菌（Aeromicrobium yanjiei）。已经发表新种5个,正在投稿新种4个。