研究背景:骨质疏松症是一种以骨量减少,骨微观结构改变,易引起脆性骨折为特征的渐进性、全身性疾病。对于严重骨质疏松患者的关节置换术常用骨水泥型人工关节假体、伴骨缺损者行骨移植及全身性抗骨质疏松药物治疗,但术后假体移位、松动和假体周围骨折等严重术后并发症的发病率仍居高不下。此外,骨水泥界面虽在早期能起到临时固定的作用,却易老化、破裂、无法形成有效的假体界面骨整合,难以保证假体长期稳定性;骨移植面临着来源受限、供区并发症、病原体传播和排斥反应等难题;而全身抗骨质疏松药物治疗也有诸多并发症,并且全身给药的生物利用度有限,难以达到有效的局部浓度,不能显著促进缺损处的骨形成。随着骨组织工程技术的发展,虽已经制备各种生物活性支架用于促进骨再生,但骨质疏松的骨整合仍然是一个重大的挑战。因此,对骨质疏松等成骨不良患者人群,研发具有良好力学性能的新型假体生物活性界面,解决上述骨质疏松患者关节置换面临的并发症将具有重要的临床意义。钛合金具有优良的生物相容性和耐腐蚀性,在骨科金属植入物方面具有很大的优势。然而,钛合金的刚度比皮质骨和松质骨要高很多,这会导致应力遮挡引起的骨溶解。制备多孔钛合金支架缓解生物力学失配,降低弹性模量是一个有效的解决途径。3D打印技术能够直接打印具有所需形状和互连孔隙的多孔支架,与传统的钛合金支架相比,3D打印技术制备的多孔钛合金(pTi)支架具有比皮质骨更高的表面积、孔结构以及更低的刚度等优异性能。多孔结构中较高的表面积以及三维孔隙连通性可通过氧气和营养物的运输促进组织粘附、生长和血管化,促进骨长入。然而,由于钛合金的生物惰性以及在骨质疏松等病理环境下与骨再生相关的高度复杂的细胞内和细胞外级联,钛合金植入物可能难以达到很好的骨整合效果。虽然3D打印的多孔钛合金支架有利于骨向支架内生长,但在骨质疏松状态下,骨再生能力仍然受到严重限制。因此,有必要对3D打印多孔支架进行再加工以刺激骨再生。为了实现更好的骨修复,下一代骨组织工程支架的发展包括三种要素,即局部药物治疗(如骨形态发生蛋白-2,bone morphogenetic protein-2(BMP-2))、细胞疗法(如骨髓间充质干细胞,bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs))和优化的支架。我们通过原位交联N-羧乙基壳聚糖(N-chitosan)、二酸二酰肼(ADH)和醛改性透明质酸(HA-ALD)制备可注射和自愈合水凝胶。这种具有自修复特性的软材料具有在损坏后恢复其功能和结构的能力,这有利于维持网状结构的完整性和水凝胶的机械性能。此外,该水凝胶可以封装药物或细胞,作为可注射材料将它们递送至靶点。本研究以BMSCs和BMP-2为模型细胞和药物,探索以搭载BMSCs和BMP-2的水凝胶填充的多孔钛合金支架为生物活性界面对骨质疏松性骨缺损的骨整合效果。方法:1.制备生物相容性较好的可注射、自修复水凝胶作为细胞载体和药物递送系统,制备具有良好力学性能的3D打印钛合金微孔支架孔隙中填充水凝胶。2.使用扫描电镜对材料外貌进行观察;利用Micro-CT和万能力学试验机探究3D打印多孔钛合金支架的孔径、孔隙率和力学性能。3.采用皮下注射检测水凝胶生物相容性与体内降解速率;以搭载BMP-2的水凝胶填充多孔钛合金支架后在体外进行释放行为研究。4.体外细胞实验利用CCK-8和活-死细胞染色观察BMSCs在复合体系中的增殖、活力情况;在体外成骨诱导作用下进行茜素红染色和实时定量PCR(RTqPCR)探讨复合支架体系在对BMSCs成骨分化的影响。5.骨质疏松家兔模型建立:双侧卵巢切除后8个月,检测假手术组与卵巢切除组家兔雌激素水平,Micro-CT和组织学检查骨量变化。6.体内实验在双侧卵巢切除后制备的骨质疏松家兔模型中进行,分为五组:多孔钛合金空支架(S)、填充水凝胶的钛合金多孔支架(SG)、多孔钛合金支架填充搭载BMSCs的水凝胶(SGC)、多孔钛合金支架填充搭载BMP-2的水凝胶(SGB)和多孔钛合金支架填充搭载BMSCs和BMP-2的水凝胶(SGCB),将各组支架体系植入股骨远端骨缺损中,利用Micro-CT、组织学检测、力学推出实验进一步研究该复合支架体系对骨质疏松性骨缺损骨整合的效果。结果:1.成功制备可注射、自修复水凝胶,各成分混合后约1分钟可成凝胶状态,电镜下水凝胶呈多孔状,孔径100—200μm。3D打印多孔钛合金支架孔径793.4±16.9μm,孔隙率69.2±0.9%,抗压强度和弹性模量分别为48.0±2.1 MPa和1.63±0.2 GPa。2.水凝胶在体内由于多种酶的作用,大鼠皮下注射后28天降解,且不引起明显的炎症反应,生物相容性良好。多孔支架填充搭载BMP-2的水凝胶,在体外可持续释放BMP-2达42天。3.相比于钛平板(Con)、S和SG组,在SGB形成的复合体系中植入BMSCs显示该体系具有良好的生物相容性,利于BMSCs增殖和活性;经过7天和14天的成骨诱导培养之后,SGB体系促进BMSCs矿化,上调ALP、Runx-2、OCN和Col-1等成骨相关基因的表达。4.骨质疏松家兔模型建立:双侧卵巢切除后8个月,相比于假手术组,卵巢切除组雌激素水平下降,骨量明显降低。5.将该材料体系植入骨质疏松家兔股骨远端骨缺损中,并在3个月后获取骨组织。Micro-CT显示相比于SG和S组,SGCB、SGB和SGC显示更高的骨体积比(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数目(Tb.N)和较低的骨小梁分离度(Tb.Sp),尤其在SGCB组。硬组织切片与Micro-CT结果一致。力学推出实验,证实SGCB(126.51±13.78 N)的骨-支架整合强度明显高于SGB(96.02±9.27N)、SGC(87.72±13.41 N)、SG(64.99±11.48 N)和S(57.16±13.60N)。结论:在这项研究中,我们成功地制备了与骨具有相似的力学性能的3D打印多孔钛合金支架和生物相容性水凝胶。填充搭载BMSCs和BMP-2的自愈性水凝胶复合支架在体外可以持续释放具有生物活性的BMP-2和利于BMSCs成骨分化。作为一个协同治疗,搭载BMSCs和BMP-2的水凝胶填充到支架可以诱导骨生长和促进骨质疏松性骨缺损的骨整合。