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目的探讨类弹性蛋白多肽(ELP)的可逆相变循环(ITC)特性,以及运用ELP作为标签对In目的蛋白进行表达纯化,观察ELP融合蛋白的ITC性质以及影响其可逆相变温度的因素,以期获得ELP在更多蛋白分离纯化中的应用。方法1.ELP基因及其引物,目的基因In及ELP-In连接引物的合成,并以合成基因为模板进行扩增。2. ELP/pGEM-T easy, ELP-In/pGEM-T easy重组克隆载体的建立,将构建好的载体转化至大肠杆菌DH5α感受态中,涂LA固体培养基平板,挑取单克隆至LB液体培养基中培养,送去测序。3.将测序正确的单克隆菌液取少量用于提取质粒,进行双酶切后胶回收目的片段,连接至表达载体pET28b中,构建重组表达载体ELP/pET28b和ELP-In/pET28b,分别将其转化至大肠杆菌DH5a感受态中进行扩增,然后提取质粒双酶切验证后,将质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,涂LK固体培养基平板,挑取单克隆至LB液体培养基中培养,进而用IPTG诱导表达。4.利用Western Blot技术分别检测ELP/pET28b, ELP-In/pET28b是否表达及其表达形式。5.将纯化的ELP-In/pET-28b蛋白用BCA法定量,稀释成浓度为1.0μM/μl,分别取600μl于1.5ml EP管中,置于5℃,10℃,15℃,20℃,25℃,30℃,35℃和40℃水浴保温15min,再分别取400μl于比色杯中用分光光度计测OD350。相变温度Tt即为OD350最大吸光度值一半时的温度。6. ELP/pET28b, ELP-In/pET28b表达成功后,观察(NH4)2SO4浓度和pH对可逆相变温度的影响,确定最合适的条件,用ITC性质分别对其进行纯化,再过镍柱后得到进一步纯化。结果1.合成ELP,In模板和相关引物,并扩增出相应的目的基因。2. ELP/pGEM-T easy, ELP-In/pGEM-T easy重组克隆载体经菌液PCR跑琼脂糖凝胶电泳有目的条带后送去测序正确,说明重组克隆载体构建成功。3.测序正确菌种提取质粒,分别双酶切后连接表达载体pET28b转入DH5α,菌液PCR跑琼脂糖凝胶电泳有目的条带,提取质粒转入BL21(DE3),菌液PCR鉴定有目的条带,提示重组表达载体建立成功。4.分别诱导表达后经Western Blot检测后显示ELP/pET28b, ELP-In/pET28b均在蛋白水平上有表达,且呈可溶性形式表达。5.经分光光度计检测,检测不到ELP/pET28b的可逆相变温度,而检测到ELP-In/pET28b的可逆相变温度约为30℃C。6.观察(NH4)2SO4浓度和pH对可逆相变温度的影响,根据影响因素,将ITC条件确定为(NH4)2SO4为0.4M,pH6.0和Tt为25℃,ELP-In/pET28b可得到初步纯化,再利用pET28b上的His标签过镍柱后得到进一步纯化。结论本实验成功合成融合蛋白并诱导表达出可溶性形式表达的融合蛋白ELP/pET28b和ELP-In/pET28b,实验检测不到ELP/pET28b的可逆相变性质,这与之前有关报道相符,但可检测出融合了目的蛋白的ELP-In/pET28b的可逆相变特征。故我们设计的小分子量ELP可能能够作为初步纯化标签应用,为下一步分离纯化更多重组蛋白奠定了基础。