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目的:
1.扩增12S:rRNA基因,建立一种能够在同一反应条件下鉴定多个具体物种,同时又满足简单、快速、特异、灵敏、准确等实用要求的种属鉴定方法。
2.用建立的方法对特殊处理检材和混合检材进行种属鉴定研究。
方法:
从GenaBank中搜索出人、鸡、鸭、鹅、猪、兔、鼠、绵羊、水牛、狗、山羊等11个物种的12S rRNA基因全长序列,用BioEdit软件比对后,设计一对针对上述11个物种的通用引物和分别针对人、鸡和鸭等目标种属的特异引物,同时扩增各物种12S rRNA基因,根据扩增片段的大小差异鉴定种属。以通用引物扩增片段为参照,特异引物扩增片段用于种属鉴定,分别对陈旧血痕、新鲜/冰冻肌肉、高温处理肌肉、毛干等单一组份检材和二元混合生物检材进行鉴定;特异引物扩增目标种属和非目标种属12S rRNA基因以检测其特异性;目标种属扩增产物的测序结果与GenBank既有序列比对,根据其Identities分值的高低判断被检序列与既有物种序列的一致性程度,从而检测该法的准确性;对单一检材、混合检材稀释成不同浓度后扩增,检测本法的灵敏度;用盲测法检验本法的实用性。
结果:
通用引物扩增11个物种的12S rRNA基因,各物种不同类别检材均有400bp左右的扩增片段,其中人394bp、鸡402bp、鸭395bp、猪404bp、鹅392bp、绵羊402bp、牛403bp、鼠399bp、兔398bp、山羊401bp、狗399bp;针对人、鸡和鸭的特异引物只对各自目标种属有扩增产物,未见交叉扩增现象,各目标种属的特异片段大小为:人163bp、鸡286bp、鸭374bp;目标种属测序结果与GenBank既有序列比对,Iderltities分值:人100﹪、鸡99﹪、鸭100﹪;灵敏度检测:目标物种的通用引物扩增,灵敏度为2.5pg;特异引物扩增人为2.5pg,鸡、鸭均为200pg;对混合检材研究表明,组份DNA在混合DNA中的含量只要高于检测灵敏度即可被准确检出,且不受其他组份干扰;盲测结果与实际检材完全相符。
结论:
本研究通过设计通用引物和特异引物,扩增不同物种、不同类别检材的12S rRNA基因,实现了同一PCR反应条件扩增多个目标物种的目的基因,从而可同时鉴定多个物种的种属。在国内首次对人和动物的混合检材进行了种属鉴定研究。所建立的方法操作简单、灵敏度好、结果准确、有高度的特异性和较强的实用性,为法医学实践和打击走私动物提供了一种崭新的方法。