目的 肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）是由间质细胞产生的一种细胞因子，具有促使细胞分裂、移动和组织器官的形态发生，以及诱导和启动肝再生的作用，在肝脏、肺脏和肾脏等脏器的损伤后再修复中发挥重要作用。本实验采用真核表达质粒，在哺乳动物细胞株CHO-K1中表达了重组人肝细胞生长因子（recombinant human hepatocytegrowth factor，rhHGF），并对其进行初步纯化。由于rhHGF的表达水平较低，难以获得足量的rhHGF进行体内实验，因此，将表达质粒导入小鼠体内，观察rhHGF对四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl₄）诱导的小鼠肝纤维化的拮抗作用，并对其作用机制进行研究。方法与结果 根据实验目的，本文的实验可分三部分：1、rhHGF在CHO-K1细胞中的表达 聚乙烯二醇沉淀法纯化真核稳定表达质粒pEE14/rhHGF，用Lipofectin试剂介导质粒DNA转染入CHO-K1细胞中，蛋氨酸亚氨基代砜（methionine sulfoxmine，MSX）筛选阳性细胞克隆。通过逆转录聚合酶链式反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）法，从阳性克隆细胞中扩增出人HGFmRNA特异性396bp片段，证实rhHGF在mRNA水平上得到表达；通过酶联免疫吸附实验（enzyme linked immuno sorbance assay，ELISA）确定培养上清液中rhHGF的含量在8-10μg/L左右，证实rhHGF在蛋白水平上得到表达。细胞培养上清液明显促使［³H］同位素标记的胸腺嘧啶脱氧核苷掺入原代培养的大鼠肝细胞，显示上清液促进肝细胞DNA的合成，表明获得的CHO-K1阳性克隆细胞株能表达有活性的rhHGF。2、rhHGF的纯化 首先应用超滤的方法除去培养上清液中分子量小于10KD的组份，随后采用Heparin-Sepharose CL6B亲和层析柱进一步分离。洗脱的组份经ELISA法检测，发现rhHGF主要分布在0.9至1.3M NaCl之间的洗脱部分。SDS－聚丙烯酚胺凝胶电泳（SDS－PAGE）显示，非还原条件下，约60KD处有较均一条带；还原条件下约62和34KD处各有一条带。［‘H同位素掺入实验表明，纯化的 hHGF明显促进大鼠肝细胞DNA的合成。3、rhHGF对小鼠肝纤维化的桔抗作用 由于获得的CHO．KI细胞株每升培养液中的表达量只有微克水平，难以大量提取纯化进行动物体内实验，因此本实验采用将hHGF表达质粒导入小鼠体内的方法，观察其对小鼠肝纤维化的保护作用。首先制作CC14诱导的小鼠肝纤维化模型，然后将 50 ug pUC七R a ／hHGF真核瞬时表达质粒包裹在仙台病毒融合蛋白－核蛋白组分HMGI脂质体混合物中，造模后第三周开始每5天一次由尾静脉注射人小鼠体内，同时设腹腔注射复方丹参为治疗对照组。在注射质粒后第1、3、5天，分别于小鼠肝脏和脾脏中可检测到rhHGFInRNA的RT－PCR扩增片段；通过ELISA法分别在注射质粒后第1、3、5、7天检测到小鼠血浆中 hHGF的含量为 40．53pg／thl、49．84pg／ffil、45．39Pg／ml、52．31Pg／ml，从而证实 hHGF在小鼠体内得到表达。8周后，取血清做生化检测，剖取小鼠肝脏制作石蜡切片，分别进行HE染色、Masson氏结缔组织染色、网状纤维的银染，结果表明，pUCSR a ／rhHGF治疗组明显降低血清谷丙转胺酶（GPT），提高血清白蛋白水平。病理切片显示，模型组肝组织呈典型的肝纤维化病变，复方丹参治疗组病变较轻，PUC石R a lrilt1GF治疗组能促进肝实质细胞增殖，明显抑制胶原纤维的沉积，病变最轻。蛋白免疫印迹法（western blot）显示，pUC习R aaHGF治疗组的肝脏中细胞增殖核抗原（proliferating cell nuclearaninen，PCNA）的表达水平高于造模组及复方丹参组，转化生长因子 6山fdrisfognifig growth factof pl，TGF fil)和口平滑肌肌动蛋白（Q SmOOthmuscle actin，a七MA）的表达水平低于造模组及复方丹参组，表明尾静脉注射 pUC石R a ／rhHGF质粒可促进CCI’诱导的肝纤维化小鼠肝细胞DNA合成，抑制TGF pl和Q－SMA的表达。结论1、获得能表达有活性 rift1GF的 CHO｛ 细胞株，表达量在 8 t以上。2、通过肝素亲和层析，获得初步纯化的具有生物学活性的rilriGF。3、尾静脉注射 PUCSR a ／rhHGF表达质粒对 CCI。诱导的肝纤维化具有 叫一 明显的桔抗作用，其机制可能在于促进肝细胞增殖以及抑制TGF pl的产 生。