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目的:研究不同剂量的无机砷对人肝星状细胞自噬水平的影响,探究三甲基腺嘌呤在无机砷诱导的自噬体-溶酶体融合的阻断作用。方法:1.RFP-GFP-LC3慢病毒感染LX-2细胞并经嘌呤霉素筛选稳定表达RFP-GFP-LC3基因的细胞株,分别用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析感染效率。饥饿处理稳定感染的细胞,激光共聚焦显微镜下观察细胞内的RFP、GFP荧光表达及自噬溶酶体的形成。2.采用CCK8检测细胞活力;确定IC50及根据具体情况确定染砷浓度既亚砷酸钠(AS3+)高、中、低剂量组和砷酸钠(AS5+)高、中、低剂量组。3.流式细胞仪（FCM）检测不同剂量无机砷对慢病毒感染后LX-2细胞凋亡及细胞周期情况。4.通过实时荧光定量（Real-Time Quantitative PCR）检测无机砷干预慢病毒感染后LX-2细胞后LC3、Beclin-1、ATG4、ATG5、ATG8、BCL-2、BCL-XL mRNA的表达水平。5.蛋白免疫印迹（Western blot）检测无机砷干预慢病毒感染后LX-2细胞后微管相关蛋白轻链3（LC3）、重组人自噬效应蛋白（Beclin-1）、泛素结合蛋白P62（SQSTM-1/P62）、跨膜蛋白49（TMEM-49）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、B淋巴细胞瘤2（BCL-2）、重组人B细胞淋巴瘤因子2XL（BCL-XL）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在细胞内的蛋白表达。6.采用CCK8法检测三甲基腺嘌呤+无机砷对慢病毒感染后LX-2细胞代谢活力。7.采用激光共聚焦显微镜观察三甲基腺嘌呤+无机砷作用慢病毒感染后LX-2细胞后RFP、GFP表达及自噬溶酶体的形成。8.PCR和Western blot分别检测三甲基腺嘌呤+无机砷作用慢病毒感染LX-2细胞的LC3、Beclin-1、SQSTM-1/P62mRNA及蛋白表达水平。结果:1.RFP-GFP-LC3慢病毒稳定感染LX-2细胞后,用流式细胞仪测定慢病毒感染率为82%,在激光共聚焦下观察其细胞形态与正常组细胞无明显差异,且红色荧光强度与绿色荧光强度也无明显差异。饥饿处理后可观察到自噬体与溶酶体融合途径通畅。2.无机砷染毒LX-2细胞,根据IC50分组,亚砷酸钠组的高、中、低剂量依次是5μmol/L、0.5μmol/L、0.05μmol/L。砷酸钠组的高、中、低剂量依次是60μmol/L、6μmol/L、0.6μmol/L。对照组及感染组为（0μmol/L）。细胞代谢活力随着剂量的升高逐渐降低。3.经流式细胞仪的检测结果分析,与空白组比较,随着无机砷浓度的增加,凋亡率逐渐升高（P均<0.05）。细胞周期检测结果显示,与空白组比较,除感染组、感染+三价砷低剂量组、感染+五价砷低剂量组G0-G1期细胞比例减少外,其余各剂量组细胞比例显著增加（P均<0.05）;与空白组比较,感染组、感染+三价砷低剂量组、感染+五价砷低剂量组S期细胞比例增加外,其余各剂量组细胞比例降低（P均<0.05）。4.与空白组比较,无机砷可上调LC3、SQSTM-1/P62、ATG4、ATG5、ATG8mRNA的表达,BCL-2mRNA随着无机砷剂量的增加而升高,BCL-XL mRNA在三价砷剂量组中随着剂量的升高而降低（P<0.05）。5.与空白组比较,无机砷上调了LC3、SQSTM-1/P62、TMEM-49、BCL-XL的蛋白表达,下调了mTOR蛋白的表达,Beclin-1随着无机砷剂量的升高呈下降趋势,BCL-2随着无机砷剂量的升高呈现上升趋势,无机砷显著上调了α-SMA蛋白表达,三价砷中剂量组升高明显（P<0.05）。6.各干预处理24、48h,与空白组比较,感染组细胞活性差异无统计学意义（P均>0.05）,其余各干预处理组细胞活性均下降明显（P均<0.05）。7.无机砷单独处理、三甲基腺嘌呤（3-MA）单独处理及三甲基腺嘌呤+无机砷处理慢病毒感染后LX-2细胞,共聚焦显微镜下观测RFP、GFP及双荧光融合,双荧光融合的黄色荧光斑点及红色荧光斑点较多,三甲基腺嘌呤联合无机砷处理组绿色荧光较红色荧光强,双荧光融合后的黄色荧光斑点较无机砷单独处理组增加。8.与空白组比较,无机砷组及3-MA+无机砷组均上调LC3、Beclin-1、SQSTM-1/P62基因及蛋白表达。结论:无机砷可诱导人肝星状细胞发生细胞凋亡和自噬,两者可能存在拮抗作用。三甲基腺嘌呤抑制LX-2细胞活性并降低无机砷诱导的自噬水平,从而可能抑制无机砷所导致的肝纤维化进展过程。砷致肝纤维化发生机制还有待做进一步研究。