水稻作为生物学研究的单子叶模式植物,也是全球最重要的粮食作物之一。控制水稻雄性繁殖的过程对选择性育种以及杂交水稻的商业开发至关重要。植株的雄性生殖发育取决于花药的正常发育和雄配子体（花粉）的形成,这一过程中花药壁中绒毡层起着非常重要的作用,而绒毡层细胞中不同细胞器间协同作用有利于花粉发育过程的正常进行。研究发现,绒毡层中线粒体异常,将导致花粉败育,而关于绒毡层质体发育与花粉发育的研究报道较少。实验室前期研究发现,通过RNA干涉可降低细胞质定位的PPR蛋白Os PPR2-1的表达,导致绒毡层中质体发育异常,花粉育性下降。但是,调控机理并没有阐明。本研究是在前期研究基础上,用转录组方法筛选、确定调控质体发育与维持的Os GLK1为Os PPR2-1的候选靶基因。为阐明Os GLK1在花药发育过程中的功能,构建Os GLK1的过表达以及CRISPR/Cas9载体,经过遗传转化分别得到稳定表达的株系,通过表型观察、生物信息学分析和细胞学观察等技术方法,揭示了Os GLK1在调控水稻花粉发育中的功能,确认Os GLK1为Os PPR2-1的靶基因。主要研究结果如下:1.构建了Os PPR2-1的CRISPR/Cas9载体,通过转化水稻中花11,获得表达下降的株系,这些株系都表现为育性下降,绒毡层降解延迟,质体发育异常。和干涉Os PPR2-1的结果类似。2.通过Os PPR2-1表达下调植株的花药转录组分析发现,108个基因在Os PPR2-1表达下调植株花药中的表达增加,其中包括调控质体发育与维持的基因Os GLK1。经q RT-PCR进一步确认,Os GLK1在Os PPR2-1表达下调植株的花药中表达量明显上调;通过RNA免疫共沉淀证明,Os PPR2-1可以特异性的结合Os GLK1的编码区,因此,将该基因确认为Os PPR2-1调控的靶基因。3.通过对水稻中的GLK1蛋白进行系统发育分析,发现在水稻中与Os GLK1同源性最高的是Os GLK2,且GLK蛋白在不同物种中具有一定的保守性。4.通过q RT-PCR和原位杂交分析Os GLK1的时空表达模式,发现Os GLK1在水稻的各个组织中都有表达,其中在营养组织中,叶片中的表达量最高;在花药发育过程中,Stage 5和Stage 6表达量最高,随后表达量下降,Stage 12几乎检测不到。5.对Os GLK1过表达以及CRISPR/Cas9突变体植株和野生型植株进行表型对比分析发现,Os GLK1过表达植株的花药部分卷曲,颜色浅淡,成熟花粉粒的碘化钾可染率以及结实率都明显下降;突变体植株的花药形态健康,花粉粒饱满,碘化钾可染率以及结实率有略微下降。6.细胞学观察表明,Os GLK1转基因植株在花药发育过程中主要表现为绒毡层细胞的发育和降解异常,且过表达植株绒毡层细胞不能按时降解,细胞层中的质体分化异常,小孢子不能正常发育;突变体植株绒毡层细胞比野生型植株的更厚且更为致密,到了Stage 11才有明显降解现象,大部分小孢子可在Stage 12正常发育并积累淀粉。TUNEL检测结果表明,Os GLK1的表达上调植株在花药绒毡层发育过程中,从Stage 8时期开始一直伴随有PCD过程的发生,而Os GLK1的突变体植株花药绒毡层的PCD信号持续时间比野生型更长一些,一直持续到Stage11。综上所述,Os GLK1是调控水稻非光合组织中质体发育的关键作用因子,Os PPR2-1通过与Os GLK1直接结合,清除特定阶段的Os GLK1 m RNA,调控花药绒毡层质体到造油体的发育过程,进而控制PCD和绒毡层的降解,花粉的正常发育。