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完整的细胞有丝分裂(Cell Division)过程是指细胞重新进入细胞周期(Cell Cycle),历经DNA复制(DNA Replication)、细胞核分裂(Caryokinesis)和细胞质分裂(Cytokinesis)这些重要阶段。但是,哺乳动物在出生后早期心肌细胞就丧失了有效的胞质分裂过程,最终导致成年个体50%以上的心肌细胞呈双核状态。心肌细胞仅停滞在胞核分裂阶段而不进入胞质分裂的现象为准确评估心肌再生能力带来了困难。既往评估心肌细胞增殖的一些指标如Ki67、Brdu (5-Bromo-2-deoxyUridine)、 PCNA (Proliferating cell nuclear antigen)和H3P (Phosphorylated histone H3)等主要是针对DNA复制和核分裂过程,不能客观地反映心肌细胞是否发生了胞质分裂过程。因此,探索精确有效的心肌细胞增殖评估方法是心脏再生研究的重要方向之一。近期的研究指出细胞周期相关基因评分(Cell Cycle Progression Score, CCP-Score)能够准确评价各种肿瘤细胞的增殖情况,从而有效判断肿瘤的预后。借鉴这种多基因评分(Muti-gene Score)方法在肿瘤细胞增殖研究的成功经验,考虑心肌细胞增殖分裂的特殊性,根据既往文献的报道我们选取了10个与细胞胞质分裂密切相关的基因制定能够评价心肌细胞增殖的多基因评分,所有选取的基因都能调控心肌细胞胞质分裂进程,表达胞质分裂需要的结构蛋白,促进完整细胞分裂正常进行。通过Real-time PCR检测各基因在不同增殖状态下心肌细胞中的相对表达量,对PCR结果进行数学公式计算得出由这10个胞质分裂基因整合而成的多基因评分,通过体外细胞实验首先建立该胞质分裂相关基因评分(CC-Score),同时证实CC-Score能够有效区分细胞DNA复制、核分裂和胞质分裂这3种不同增殖状态,最终在体评价出生后小鼠心肌细胞的增殖能力。通过不同层次地验证,进而为该方法在心脏再生中评估心肌细胞增殖能力的应用提供坚实的研究基础。主要的研究结果如下：第一部分：目的：建立胞质分裂基因评分(CC-Score)系统。方法：根据NCBI的基因注释和文献报道,选取了10个与心肌细胞胞质分裂密切相关的基因包括：Anln, Aurkb, Cenpa, Kif4, Kif23, Prcl, RhoA, Spinl, TACC2和CDC42,用于制定评价心肌细胞增殖的多基因评分系统。将H9C2心肌细胞分别用促生长激素释放激素(GHRH)、成纤维生长因子(FGF-1)和DMSO、IFN-α处理,以及血管紧张素Ⅱ和内皮素Ⅰ处理,分别模拟细胞增殖促进、抑制和细胞肥大的状态。同时应用传统心肌细胞增殖评价方法包括MTT法、Brdu法、细胞免疫荧光染色和流式细胞周期分析法与新型CC-Score进行比较分析。结果：在GHRH组H9C2心肌细胞CC-Score的平均值为+3.39(P<0.01),而在FGF-1组H9C2心肌细胞CC-Score的平均值为+3.22(P<0.01)；然而,在细胞增殖抑制组,经DMSO干预处理后的H9C2CC-Score的平均值为-1.47(P<0.01),经IFN-α干预处理后的H9C2心肌细胞CC-Score的平均值为-0.93P<0.05)；在细胞肥大组,经血管紧张素Ⅱ处理后的CC-Score的平均值为+0.15(P>0.05),经内皮素Ⅰ处理后的H9C2肌细胞CC-Score的平均值为+0.09(P>0.05)。与传统方法匹配分析,发现在GHRH和FGF-1增殖促进组胞质分裂基因评分为正值(P<0.01),在DMSO和IFN-α增殖抑制组胞质分裂基因评分为负值(P<0.01),正值提示细胞增殖能力旺盛、增殖活跃；负值表示细胞增殖能力受到抑制、增殖受限,在细胞肥大组无明显差别(P>0.05)。结论：CC-Score的结果与MTT法、Brdu法、细胞免疫荧光染色和流式细胞技术这些经典的细胞增殖分析方法结果是相似的。说明CC-Score能够有效反映心肌细胞不同增殖状态,并能够有效区分心肌细胞增殖(Proliferation)和肥大(Hypertrophy)两种不同的生长状态。第二部分：目的：进一步明确CC-Score能有效区分心肌细胞DNA复制、核分裂及完全的分裂状态。方法：利用秋水仙素、细胞松弛素D和GHRH分别处理H9C2心肌细胞,制备心肌细胞DNA复制、核分裂和胞质分裂三种不同分裂状态的细胞模型。应用CC-Score评分系统对种不同分裂状态的心肌细胞进行评估。并与传统MTT法、Brdu法、细胞免疫荧光染色和流式细胞法比较分析。结果：通过计算CC-Score,经GHRH干预处理的H9C2心肌细胞CC-Score的平均值为+3.37(P<0.01)；细胞增殖抑制组,经IFN-a干预处理后的H9C2心肌细胞CC-Score的平均值为-0.95(P<0.05)；在DNA复制组,经秋水仙素处理后的H9C2心肌细胞CC-Score的平均值为+0.10(P>0.05)；在核分裂组,经细胞松弛素D处理后的H9C2心肌细胞CC-Score的平均值为+0.07(P>0.05)。DNA复制组和核分裂组与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。GHRH组和IFN-α组与对照组有明显的统计学差异(P<0.01)。结论：CC-Score能够有效地区分H9C2心肌细胞DNA复制、核分裂及完全的细胞分裂(胞质分裂)3种不同的分裂状态。而传统的方法不能有效区分这3种状态,从而进一步提示CC-Score能够更为科学地反映心肌细胞的真实增殖情况。第三部分：目的：应用CC-Score评估小鼠出生后心肌再生能力的变化。方法：应用CC-Score对出生后1-7天小鼠心肌再生进行评价,同时还选择了8个与细胞DNA复制和核分裂相关的基因,制定了类似胞质分裂基因评分的CCP-Score,使用这2种评分系统同时对小鼠出生后心肌再生能力和心肌细胞增殖情况改变进行评价。同时应用组织免疫荧光染色Ki67和H3P这两种常用的增殖标记物同时对出生后1-7天小鼠心脏再生增殖情况进行评价。结果：CC-Score和CCP-Score对于评价出生后小鼠心脏再生和心肌细胞增殖情况存在着明显的差异。对于CC-Score而言,小鼠心肌细胞增殖能力在出生后的1-7天呈逐渐减弱的趋势,在第4天未出现增殖峰值,心脏再生增殖能力呈线性下降；对CCP-Score而言,小鼠再生能力在第4天出现明显加强,达到增殖峰值,在第7天增殖再生能力基本丧失。同时组织免疫荧光结果提示小鼠再生能力在第4天出现明显加强,达到增殖峰值。由此可见,免疫荧光的结果与CCP-Score相一致,与CC-Score的结果出现了较大的差异。结论：虽然组织免疫荧光方法和CCP-Score结果是一致的,但是组织免疫荧光方法和CCP-Score只能评价心肌细胞核分裂状态,不能有效区分心肌细胞增殖和多核状态。CC-Score作为一种简单易行的新型心肌细胞增殖评价方法,能够有效地区别心肌细胞核分裂状态和胞质分裂状态,从而能够真正准确地在体评价心肌细胞增殖变化情况。