论文部分内容阅读
目的:探讨敲低基质金属蛋白酶21(matrix metallopeptidase 21,mmp21)基因对斑马鱼胚胎左右不对称发育的影响。方法:在斑马鱼胚胎1~2细胞期显微注射吗啉反义寡核苷酸(morpholino antisense oligonucleotides,MO)敲低mmp21基因的表达。(1)逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测mmp21 MO的有效性。(2)利用整胚原位杂交(whole mount RNA in situ hybridization,WISH)检测心脏和心外器官(肠道、脑)标志物以评价斑马鱼胚胎左右不对称发育情况。(3)通过观察活体胚胎心脏、计数心率和测量心室收缩分数(ventricular shortening fraction,VSF)评价心脏功能的改变。(4)体视显微镜下观察活体胚胎库氏囊泡(Kupffer’s vesicle,KV)并拍照,利用Image J测量KV面积。(5)通过整胚原位免疫荧光(whole mount in situ immunofluorescence)对乙酰化微管蛋白(acetylated-tubulin,AC-tubulin)染色以评价纤毛变化。(6)通过WISH检测中线屏障标志物以观察中线屏障的改变。结果:mmp21 MO能有效敲低mmp21基因。敲低mmp21基因导致斑马鱼胚胎心脏、肠道以及脑部标志物左右随机分布,随着mmp21MO浓度的增高,异常比例增高;活体胚胎心脏结构异常,表现为心房、心室左右随机分布;心脏功能损害,表现为心率减慢、心室收缩分数减少(p<0.05);KV面积变小(p<0.05),囊泡内运动纤毛数量减少、长度变短(p<0.05);中线分子屏障lefty1部分或全部缺失。结论:敲低mmp21基因导致斑马鱼心脏和其他心外结构(肠道、脑部)左右不对称发育异常以及器官功能损害,其可能与左右不对称发育关键结构KV和纤毛缺陷,以及中线分子屏障缺失有关。本研究以斑马鱼为模式动物初步探讨mmp21基因在胚胎左右不对称发育中的作用,为今后深入研究mmp21基因奠定了基础,同时也为mmp21基因在人类胚胎发育中的作用带来新的启示。