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宏基因组学是一种对直接来自于环境样品中的微生物群体基因组进行研究的新的微生物研究领域。本论文基于宏基因组学研究方法在环境微生物研究中的众多优势，拟应用这一近年新兴的研究方法对家蚕肠道中细菌种群构成进行调查分析，及对水环境微生物中的整合子-基因盒的分布、信息编码情况及其在环境微生物基因组进化中作用作一个初步的研究探讨。
一、近年来快速发展的分子生物学研究证实，在多数的生态环境中可培养的微生物只占生态系统中微生物总数量的一小部分。因此，通过传统的培养方法获得的特定环境中微生物的群落结构信息显然是很不全面的。为了更加全面地了解家蚕肠道内微生物的群落结构及它们的生理功能，我们采用了宏基因组学的方法和传统培养法相结合来进行研究。宏基因组的方法是：绕过培养障碍，用SDS-高盐法和SDS-高盐-冻融法直接提取家蚕肠道微生物的总DNA(即宏基因组DNA)，扩增并建立细菌16SrDNA基因文库，再用RFLP分析技术对文库进行筛选，对所获得的序列进行测序，比对分析，构建系统发育树；同时对这些细菌在家蚕肠道内所起的作用进行探讨。
两种四碱基限制性内切酶MspⅠ、HaeⅢ酶切分析16SrDNA基因文库后，从205个阳性克隆中存在发现有16种不同的酶切谱型。其中MspⅠ消化后有11种差异谱型，HaeⅢ消化后有5种差异谱型。从所获得的16种酶切谱型中选择出代表性克隆进行测序，并将序列提交美国国家生物信息中心(NCBI)进行同源性比对。分析显示，16条序列中有7条与6个已知的细菌属具有同源性，分别是节杆菌属(Arthrobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、大肠杆菌属(Escherichia)、芽胞杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和假单胞菌属(Pseudomonas)。另外9条序列与一些未知细菌的16SrRNA基因具有较高的同源性。系统发育树分析表明，SWM22的来源菌可能与家蚕体内营养物质及能量的转化有关；SWM90、SWM99、SWM8、SWM35、SWM145的来源菌可能使家蚕致病；SWM94的来源菌可能能够促进家蚕营养的转化与吸收。SWM2、SWM19、SWM34、SWM35、SWM42、SWM62、SWM86、SWM94、SWM98、SWM141因只与一些未知细菌具有同源性，因此它们的来源菌与宿主家蚕的关系我们也不得而知。
另外，采用传统的培养法，我们获得了葡萄球菌属、芽胞杆菌属、乳杆菌属、节杆菌属、埃希氏菌属共5个属6个种的细菌，其序列与未培养法获得序列中的6条具有很高的同源性。结合非培养法研究所得到的结果。比较分析了培养法和非培养法在环境微生物生态学研究中的优劣。认为，非培养法和培养法均有各自的优点和不足，两者具有较强的互补性。
二、整合子是一个能够通过自身编码的整合酶来获取胞外游离基因或基因片段并使之表达的遗传元件系统。整合子所捕获的DNA单元—基因盒，是迄今为止已知的最简单的移动元件。本研究以根据基因盒中每个基因两侧的59-碱基元件(59-baseelement，59-be)保守序列设计的引物HS286-HS287作为扩增引物，以PCR的方法从环境微生物的宏基因组DNA中扩增基因盒，期望能够发现一些新的关于整合子-基因盒系统的有用信息。
从采集的水样品中提取到环境微生物宏基因组DNA，以HS286-HS287为引物扩增到了特异性条带，大小在300-2000bp之间。将PCR产物与pMD18-T载体连接，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆，测定其插入片段的核苷酸序列。信息学分析表明，我们共得到7个不同的整合子-基因盒，含有13个可能的ORF。把推导的氨基酸序列通过BlastP比对发现后，发现这些ORF与数据库中的一些蛋白质的序列有较高的同源性，其中5个序列为变形细菌的假设蛋白；一个为真菌的假设蛋白；一个为同样来自于整合子-基因盒研究的假设蛋白序列。另外6个推导蛋白分别与变形细菌的功能蛋白木酮糖激酶、ComEC/Rec2类蛋白、β-内酰胺酶、DNA修复蛋白RecN、Na/Pi共转运体蛋白及放线菌假诺卡氏属菌的Tuf1具有较高的相似性。其中orf9-19＃、orf10-20＃分别与来自于α-变形细菌苜蓿中华根瘤菌的β-内酰胺酶、γ-变形细菌一个未培养的假单胞菌属的DNA修复蛋白RecN具有很高的相似性。我们重点分析了19＃和20＃基因盒。
19＃的序列全长1800bp,正反向各有两个ORF。其中orf9-19＃位于19＃基因盒反向序列的531-1718位，共编码396个氨基酸。对其氨基酸序列进行分析后发现orf9_19＃中含有C类β-内酰胺酶特有的三个高度保守序列，它们分别是S94VSK、Y180SN、K343TG。对A、B、C、D四类β-内酰胺酶的氨基酸序列进行聚类分析后表明orf9_19＃与C类β-内酰胺酶处于同一进化枝上。故我们可以确定orf9_19＃为C类β-内酰胺酶。
在20＃基因盒序列中，我们预测到一个编码DNA修复蛋白RecN的基因orf10_20＃。根据RecN蛋白的功能特异性及前人对DNA修复系统的进化研究结果使我们有理由相信在本次整合子-基因盒系统研究中所得到的与RecN相似的基因与微生物或其它生物的DNA修复系统的进化有关。
我们的研究结果表明整合子-基因盒系统是一个在环境中广泛存在的遗传元件，它不仅仅可以作为细菌抗生素抗性的传播平台，同时它也是一个多样性十分丰富的遗传资源库。另外它还可以作为细菌基因组进化的一个工具。