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本论文以高温榨油后的花生粕为原料提取花生分离蛋白,重点研究了高压预处理结合酶解对花生分离蛋白的改性效果,包括酶解产物的理化性质、结构变化以及生理活性肽的纯化与鉴定。
首先采用L9(34)正交设计优化了利用碱溶酸沉法从花生粕提取花生分离蛋白的工艺条件。以花生分离蛋白的提取率为指标,确定各因素对提取率的影响大小为温度>pH>料液比>时间,最佳提取条件为提取温度为60℃、pH值为10、料液比为1:8,时间为60 min。按此组合,蛋白提取率为36.21%。
对花生分离蛋白水解的最佳用酶进行了筛选。以碱性蛋白酶Alcalase的水解效果最好。在单因素实验基础上,以水解度为指标,设计了响应面分析方案,建立了指标与各因素间的数学模型,并分析因素间交互作用,得出水解度最大所需的工艺参数为反应温度53.11℃、酶浓度为135.94 uL/g、pH为8.05、预测蛋白水解度为24.57%。通过数学推导及实验分析,得出Alcalase可控酶解花生分离蛋白的动力学模型及相关参数,分别为:DH.=7.353In[1+(1.484Eo/So+0.0269t]和R=(10.913Eo+0.1981So)exp[--0.136(DH)],动力学常数k2=10.913(min-1),酶失活动力学常数为kd=1.7701(min-1),最低临界初始蛋白酶浓度Eo=CoSo,最大临界底物初始浓度So=Eo/Co,水解常数Co=1.815x10-2。
采用100 MPa、300 MPa和500 MPa高压处理,以未处理蛋白为对照,对花生分离蛋白按之前优化的酶解方案进行酶解。对各处理的酶解产物的水解度、抗氧化活性、凝胶过滤色谱、HPLC图谱和巯基/二硫键含量进行了分析比较。结果表明,300 MPa的高压处理对水解度的影响最大,以120 min酶解产物抗氧化活性较好;经高压处理的蛋白酶解产物分子量分布与对照相比变化较大,酶解产物中短肽成分更多:但高压处理后蛋白酶解产物的液相图谱与对照差别不大;经高压处理的蛋白酶解产物中游离巯基含量相对高于对照,而二硫键含量则相反。
利用不同截留分子量的超滤膜块对经300 MPa高压处理后120 min酶解的产物进行分离,得到四个不同组分:未截留组分、>5K组分、5K-3K组分、<3K组分。以膜通量和不同组分酶解产物的回收率为衡量指标,确定超滤条件为酶解120 min、4%浓度水平、转速为100 rpm。另外,不同组分的凝胶过滤色谱也有差别,>5K组分的出峰时间和起始出峰时间均是最早。氨基酸分析表明,<3K组分的疏水性氨基酸、碱性氨基酸、极性氨基酸、芳香族氨基酸和支链氨基酸的含量均是最高,而酸性氨基酸含量最低。5 K-3 K和<3K组分的抗氧化水平和血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性均显著高于>5K和未超滤组分,说明分子量较小的肽组分有较强的生理活性。
利用大孔吸附树脂对水解度高、抗氧化活性强的PPIH<3 K组分进行了脱色和脱盐处理,最后利用凝胶过滤色谱SephadexG-25将PPIH<3 K分成3个主要组分P1、P2和P3。对这三个组分的DPPH自由基清除活性和ACE抑制活性测定后,筛选出P3的DPPH自由基清除活性(46.83%)和ACE抑制活性最强(65.66%)。HPLC图谱显示P3的疏水性最强;利用液质联用色谱(RP-HPLC在线连接ESI-MS/MS)结合氨基酸分析最终鉴定出P3中功能肽因子的氨基酸序列为Tyr-Cys-Ala-Asp,分子量为471.1 Da。
还考察了高压均质处理对花生分离蛋白功能特性和酶解特性的影响。40MPa和80 MPa的高压均质处理能有效改善花生分离蛋白的功能特性,包括可以显著提高花生粕蛋白提取率,改善在酸性范围内的溶解性,不同程度地改善乳化性、起泡性、持水性、热变性及微观结构。高压均质处理还能提高花生分离蛋白的水解效果、小分子量肽段的释放及酶解产物的抗氧化活性。