第一部分 长链非编码RNA LINC00578在卵巢浆液性腺癌转移中的功能及机制研究 第二部分 纳米炭在子宫颈癌和子宫内膜癌前哨淋巴结活检术中的初步研究

来源 :北京协和医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yushilv
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目的:寻找卵巢浆液性腺癌原发灶和转移灶差异表达的长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA),研究其在卵巢癌组织及细胞系中的表达,对卵巢癌细胞生物学特征的影响,以及调控转移的分子机制。方法:本研究通过对卵巢浆液性腺癌的原发灶和匹配的转移灶肿瘤组织进行高通量LncRNA表达谱测序,筛选出差异表达显著的LncRNA。随后采用实时定量聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法进一步在新鲜卵巢浆液性腺癌组织和匹配的转移癌组织中验证LncRNA的表达差异。在卵巢浆液性腺癌患者的组织芯片中采用原位杂交的方法检LncRNA的表达,分析其与患者临床病理资料以及生存预后之间的关系。随后通过Transwell实验、划痕愈合实验、细胞计数盒-8(cell count kit-8,CCK-8)等实验在体外条件下检测LncRNA对卵巢癌细胞侵袭、迁移和增殖能力的影响。随后将构建好的LncRNA稳定敲降和过表达的卵巢癌细胞株,采用腹腔注射方式注射到裸鼠体内,通过动物活体成像方法和腹腔解剖的方式,观察LncRNA在体内条件下对卵巢癌细胞生长、浸润及转移能力的影响。通过RNA pull-down寻找与LncRNA直接结合的蛋白,以及RNA测序分析(RNA-sequencing,RNA-seq)结合基因富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)寻找LncRNA参与调控的细胞通路,探索LncRNA调控卵巢癌转移的分子机制。结果:1)本实验通过5对ⅢC期卵巢浆液性腺癌原发灶和匹配的转移灶肿瘤组织转录组测序分析,筛选出了原发灶和转移灶差异表达显著的13个LncRNA,其中6个在转移灶中表达显著高于原发灶,7个在转移灶中表达显著低于原发灶。LINC00578是转移灶表达高于原发灶最显著的因子。进一步在26例卵巢浆液性腺癌患者的原发灶和转移灶新鲜肿瘤组织中进行验证,结果显示有l6例(61.5%)患者的转移灶中LINC00578的表达量高于原发灶。2)在卵巢浆液性腺癌组织芯片中,我们采用原位杂交的方法检测LINC00578的表达水平,发现LINC00578的表达水平与患者的预后相关。LINC00578高表达组患者的总体复发率和死亡率显著高于LINC00578 低表达组患者(92.5%vs 75.4%,P<0.01;74.6%vs 53.6%,P<0.01)。在生存期方面,LINC00578高表达组中位无进展生存期(progress free survival,PFS)和中位总生存期(overall survival,OS)均显著低于低表达组(6个月vs 8个月,P<0.05;35 个月 vs 55 个月,P<0.01)。单因素 Log-rank 检验显示,LINC00578表达水平是PFS和OS的影响因素,LINC00578高表达组的5年PFS和5年OS显著低于低表达组(7.5%vs 22.8%,P<0.05;25.3%vs 47.3%,P<0.01)。多因素 Cox回归分析显示LINC00578表达水平是卵巢浆液性腺癌患者PFS和OS的独立影响因素(P<0.05)。3)在体外条件下,我们研究了 LINC00578在细胞水平对卵巢癌细胞表型的影响。利用慢病毒包装体系构建过表达慢病毒(OE-LINC00578)和敲降慢病毒(sh-LINC00578)并对卵巢癌细胞进行感染,构建稳定过表达和敲降细胞系。Transwell及划痕愈合实验结果显示,过表达LINC00578能促进卵巢癌细胞发生侵袭和迁移,敲降LINC00578后卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力下降。CCK-8实验显示,敲降LINC00578后卵巢癌细胞的增殖能力下降。4)在体内条件下,将构建好的稳定过表达和敲降LINC00578的卵巢癌细胞株,采用腹腔注射方式注射到裸鼠体内,结果显示,过表达LINC00578后卵巢癌的腹腔转移能力增强,而敲降LINC00578后卵巢癌的腹腔转移能力下降。5)RNA-seq分析显示LINC00578主要参与了细胞外基质结构组分相关生物过程和细胞外基质受体相互作用通路,以及DNA复制相关生物过程和通路。结论:LINC00578的表达水平与卵巢癌患者预后相关,LINC00578的高表达与无进展生存及总生存差密切相关,可作为预测卵巢癌患者预后的指标。在体外条件下,LINC00578能显著增强卵巢癌细胞侵袭、迁移、增殖能力。在体内条件下,LINC00578能促进卵巢癌在腹腔中的播散转移。LINC00578的促增殖和转移作用可能与DNA复制和细胞外基质受体相互作用通路异常相关。目的:初步探讨纳米炭应用于在子宫颈癌前哨淋巴结活检术(sentinel lymph node biopsy,SLNB)中的安全性和可行性。方法:纳米炭是一种淋巴系统高度趋向性的生物活性染料,广泛用于淋巴造影。本研究分析了 2015年12月至2018年9月期间在中国医学科学院肿瘤医院妇科接受纳米炭SLNB的子宫颈癌患者。所有患者在全麻条件下于宫颈3点和9点行纳米炭混悬液(25mg)浅表注射,在腹腔镜下识别黑染的淋巴管,以第一站黑染的淋巴结为前哨淋巴结(sentinel lymph node,SLN),详细记录SLN的部位及个数,单独切除SLN后行常规双侧盆腔淋巴结切除和根治性子宫切除术。SLN与其他切除标本分别进行常规病理检查。以总检出率、双侧检出率、灵敏度、阴性预测值、假阴性率等指标评价其示踪效率和准确性。分析SLN的分布规律以及影响检出率的因素。结果:本研究共纳入了 45例宫颈癌患者,按照2009年FIGO分期,43例(95.6%)患者为ⅠB1期,1例(2.2%)患者为ⅠB2期,1例(2.2%)患者为ⅡA1期。所有患者的中位年龄为43岁(30-63岁),中位体重指数(body mass index,BMI)为23.59 kg/m2(17.5-30.0 kg/m2)。所有患者前哨示踪操作完成顺利,在术中和术后均未发现副反应发生,无中转开腹情况发生。共42例患者至少一侧盆腔成功检出SLN,总检出率为93.3%(42/45),27例患者检出双侧盆腔SLN,双侧检出率为60.0%(27/45)。共检出225枚SLN,中位SLN计数为5.0枚(0-18枚)。SLN大多数分布在常见区域(81.3%),包括髂外血管区域(39.1%)、髂内血管区域(25.8%)和闭孔区域(16.4%),而其余18.7%的SLN分布于非常见区域,包括髂总血管区(10.7%)、宫旁区域(7.6%)和骶前区域(0.4%)。根据术后病理结果,有4例证实有盆腔淋巴结转移,共4枚转移淋巴结均属于SLN,无假阴性发生,假阴性率0%,灵敏度和阴性预测值均为100%。经过进一步分析,单因素和多因素分析结果显示,BMI升高与SLN双侧检出率降低相关(P=0.015)。而年龄、组织学类型、锥切术史、学习曲线、肿瘤分化程度和脉管癌栓对SLN双侧检出率没有影响(P≥0.05)。结论:纳米炭应用于早期宫颈癌SLNB操作简单、可行、具有良好的示踪效果。目的:初步探讨纳米炭在子宫内膜癌前哨淋巴结活检术(sentinel lymph node biopsy,SLNB)中的安全性和可行性。方法:选择2016年1月至2018年9月期间中国医学科学院肿瘤医院妇科接受纳米炭SLNB的子宫内膜癌患者,所有患者在全麻条件下宫颈的3点和9点位置部位注射纳米炭示踪剂,采用浅表(1-3mm)和深层(1-2cm)相结合的办法注射0.5ml(25mg)的纳米炭混悬液。注射完成后,在腹腔镜下识别黑染的淋巴管,沿淋巴管找到第一站黑染淋巴结定位为前哨淋巴结(sentinel lymph node,SLN)。详细记录SLN的检出情况以及SLN检出的部位,单独切除SLN后行标准子宫内膜癌分期术。SLN与其他切除标本分别进行常规病理检查。通过总检出率、双侧检出率评价纳米炭法的检出效率,通过敏感度、阴性预测值、假阴性率等指标评价准确性。结果:共52例接受纳米炭示踪的子宫内膜癌患者,中位年龄53岁(28-66岁),中位 BMI25.2kg/m2(20.3-35.3kg/m2),术前评估均为临床 Ⅰ 期(44/52,84.6%)和Ⅱ期(8/52,15.4%)。所有患者的病理类型以子宫内膜样腺癌为主(48/52,92.3%),手术病理FIGO分期(2009年)显示ⅠA期30例(57.8%),ⅠB期8例(15.4%),Ⅱ期 6 例(11.5%),ⅢA 期 1 例(1.9%),ⅢC1 期 5 例(9.6%),ⅢC2 期 2 例(3.8%)。所有病例纳米炭注射操作顺利完成,在术中和术后均无副反应发生。SLN示踪情况显示,47例患者至少检出一侧盆腔SLN,总检出率为90.4%(47/52),其中37例患者检测出双侧盆腔SLN,双侧检出率为71.2%(37/52),4例(7.7%)仅检出左盆腔SLN,6例(11.5%)仅检出右侧盆腔SLN。所有患者共检出220枚SLN,中位SLN计数为4.0枚。SLN分布区域分析显示,SLN分布最多的位置是髂外血管区(40%),其次是闭孔区(24.5%),髂内血管区(21.8%),髂总血管区(11.4%)和腹主动脉区域(2.3%)。根据术后病理结果,7例(13.5%)患者最终证实有淋巴结转移,其中1例假阴性。因此,假阴性率为14.3%(1/7),敏感度为85.7%(6/7),阴性预测值为97.9%(47/48)。结论:纳米炭法应用于早期子宫内膜癌SLNB示踪高效、操作简便,值得进一步应用研究
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