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猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染引起的一种急性接触性肠道传染病,该病在临床上主要引起哺乳仔猪的水样腹泻、呕吐和脱水,尤其是对于7日龄以内的哺乳仔猪危害更大,感染后死亡率高达100%。自2010年以来,变异PEDV的出现,使得现有疫苗的免疫效果并不十分理想,因而PED现仍存在于猪场并经常发生,严重危害了养猪业的健康发展。为了研究PEDV的免疫逃逸机制以及细胞对其产生的免疫应答反应,本研究利用双向凝胶电泳(2-DE)和质谱鉴定(MS/MS)技术对PEDV感染的Vero细胞进行了差异蛋白质组学分析,以期发现新的参与免疫逃逸或免疫应答反应的蛋白分子。通过蛋白质组学分析发现,PI3K/Akt信号通路中的信号分子以及天然免疫限制性因子BST-2在PEDV感染过程中表达量发生了变化,这一结果预示着PI3K/Akt信号通路以及BST-2蛋白在PEDV感染Vero细胞的过程中发挥着重要的作用。PI3K/Akt信号通路参与调控细胞内的许多生物学功能,是细胞内重要的信号通路,在许多病毒感染细胞和细胞抑制病毒的过程中都会活化这一信号通路。天然免疫限制性因子BST-2是一种可以被Ⅰ型和Ⅱ型干扰素(IFN)诱导表达的跨膜蛋白,能够通过两个跨膜区和胞外区所形成的锁链而绑定病毒,抑制其释放感染临近细胞;同时,BST-2蛋白的胞内N端结构域也能通过激活NF-κB而抑制PEDV增殖。1.PEDV感染Vero细胞差异蛋白质鉴定蛋白质组学是近几年为全面深入了解病毒与宿主细胞间的相互作用而普遍使用的一种研究方法。本研究通过观察PEDV感染Vero细胞后引起的细胞病变效应(CPE),与利用间接免疫荧光试验(IFA)检测细胞内的病毒含量,发现PEDV感染细胞后5 h,细胞内病毒含量较高且细胞没有破碎脱落,因此确定了PEDV感染后5 h的细胞样品作为后续的蛋白质组学分析样品。利用2-DE对感染和未感染PEDV的细胞样品进行蛋白分离,共发现67个差异表达蛋白点,其中有38个上调蛋白,29个下调蛋白。利用MS/MS对分离到的差异蛋白进行鉴定,最终鉴定出58个蛋白,包含33个上调蛋白,25个下调蛋白。通过GO分析发现,所获得的差异表达蛋白主要参与能量代谢、蛋白翻译、应激反应、细胞黏附、细胞凋亡、免疫系统过程和细胞杀伤作用等生物过程,这一结果暗示了这些差异蛋白可能与病毒的免疫逃逸或细胞的免疫应答反应密切相关。为了验证蛋白质组数据的准确性,挑选4个差异表达蛋白LGALS1(下调)、Peroxiredoxin-1(下调)、SNRPC(上调)和PTEN(上调)进行western blot和荧光定量PCR验证,结果显示4个差异表达蛋白的表达规律与通过质谱鉴定所获得的蛋白质组数据基本一致,表明了质谱鉴定的结果是可靠的。2.PI3K/Akt/GSK3信号通路分子抑制PEDV增殖PI3K/Akt信号通路是细胞内非常重要的信号转导通路,既能被细胞利用而抑制病毒增殖,也能被病毒利用而改变细胞内环境利于病毒的复制与增殖。本研究发现,PEDV感染Vero细胞的过程中,能够分别于感染后的早期(5 min–15 min)和晚期(4 h后)两次激活Akt。通过LY29400的抑制试验证实Akt的磷酸化依赖于PI3K活性的调节,并且抑制Akt的磷酸化后有利于PEDV感染Vero细胞。PI3K/Akt信号通路抑制PEDV增殖是通过调控GSK3的磷酸化而实现的,用GSK3的特异性抑制剂CHIR-99021抑制其活性后,PEDV的增值明显增加。而在病毒感染Vero细胞的过程中,Akt下游信号分子mTOR、Bad、p53并没有发生变化,没有参与这一信号通路的调控作用。因此,在PEDV感染Vero细胞的过程中,既能在病毒感染早期通过病毒的结构蛋白激活PI3K/Akt信号通路,也能在病毒感染的晚期通过病毒基因的转录与蛋白翻译、病毒粒子的组装等过程激活PI3K/Akt信号通路。PI3K/Akt信号通路抑制病毒的增殖是通过调控其下游信号分子GSK3的磷酸化而实现的。3.BST-2抑制PEDV复制与增殖BST-2是一种可被IFN诱导表达的跨膜蛋白,能够利用其特殊的蛋白拓扑结构把囊膜病毒粒子粘附在宿主的细胞膜上,抑制病毒的扩散。为了研究BST-2对PEDV复制与增殖的影响,本试验扩增出猪BST-2基因的全序列(全长共851 bp,含5’-UTR序列23bp,CDS区序列534 bp以及3’-UTR序列294 bp)和启动子序列(1950 bp),并利用原核表达纯化的重组猪BST-2蛋白制备了单克隆抗体。通过对BST-2的组织分布分析发现,BST-2几乎在所有的组织器官中都有所表达,但在免疫组织及器官(淋巴结、胸腺、扁桃体、脾脏)、大肠、小肠及肺脏中的表达量较高,这也表明了BST-2蛋白可能在早期的天然免疫反应中发挥着重要的作用。在过表达BST-2蛋白的Vero细胞中,病毒含量明显低于对照细胞,细胞上清中的病毒滴度也显著下降;并且在BST-2基因敲低的Vero细胞中,PEDV的增殖显著增加,这些都表明了BST-2蛋白能够抑制PEDV在Vero细胞内的增殖。通过病毒感染过表达BST-2蛋白的Vero细胞以及荧光素酶活性检测试验可以推测出,BST-2抑制PEDV增殖,是通过蛋白的两个跨膜区和胞外区所形成的锁链而绑定病毒,抑制其释放感染临近的细胞;另外,BST-2蛋白通过其胞内N端结构域也能激活NF-κB,进而抑制PEDV的复制。