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目的:建立一种针对促红细胞生成素（EPO）的酶联免疫学检测（enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA）方法,建立相关的试剂盒。应用直接包被与间接包被方法。并运用此试剂盒对临床上相关疾病进行检测,了解其临床应用价值,指导相关疾病的诊治。方法:1.免疫层析法将购买的重组人类红细胞生成素（rhEPO）抗原纯化,紫外分光光度计法测定蛋白含量。2.抗体的纯化。用金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA）亲和层析法纯化EPO抗体。3.用辣根过氧化物酶（HRP）标记EPO抗体。4.用酶联免疫检测（ELISA）的双抗体夹心法制备直接包被的试剂盒,并对板、试剂、各种反应条件进行优化探讨。5.利用生物素—亲和素系统的优点,将酶标板包被BBC,与生物素化的抗体反应,组盒。6.将以上的直接包被法进行灵敏性、重复性、稳定性等的方法学评价。7.用试剂盒检测相关的肿瘤、贫血标本,并进行正常血清的对照试验。与医院常用的放射性免疫检测结果对比。结果:1.将抗体连接在凝胶上,装在柱子中,制成免疫层析柱,依次过以下液体:平衡液,洗脱去带分离抗原蛋白中的杂质蛋白;高盐溶液,洗去可以与凝胶柱的非特异结合蛋白;洗脱液,根据PH值的变化或者离子强度的改变,将于凝胶上的抗体结合的抗原蛋白洗脱下来。收集洗脱峰的各个部分,分装到许多小瓶中,每个小瓶1ml。测定蛋白浓度,根据经验公式:蛋白浓度=1.750D280-0.74OD260,用进口标准试剂盒测定各个收集组分,确定确为EPO抗原纯化产物。2.酶标抗体的制备采用过碘酸钠法。把HRP溶于乙酸钠,与NaIO4室温避光搅拌30min,用乙二醇终止上述氧化反应。再透析脱盐,上述酶液与抗体反应,结束后,透析离心,取上清,过Sephadex G200层析柱。得到的即为标记后的纯化酶。测定酶的量:1.2mg/ml,IgG为3.2mg/ml。3.ELISA最适条件的选择如下:对比美国COSTAR板与国产板,前者在吸附性能、灵敏性及本底方面均优于后者,选择包被COSTAR酶标板;对酶标板经过异丙醇活化和紫外照射后明显可以降低本底的干扰,并且使板条的吸附性能有所加强;反应时间最适为30min;温度37℃;直接包被的抗体浓度在以纯化的抗体的基础之上,1:600为最合适,抗原标准品包含正常范围的一系列浓度为0mU/mL、5mU/mL、10mU/mL、20mU/mL、40mU/mL、80mU/mL、160mU/mL,抗原制备的160点相当于制备纯化抗原的1:400稀释,酶标抗体的最适合浓度为:1:3000稀释。本试剂盒的范围为5～160 mU/mL,足以包含正常范围6～25mU/mL;灵敏度为0.46mU/mL;高浓度样品平均回收率为106.74%,低浓度样品平均回收率为104.78%;准确度为38.982mU/mL;稳定性良好;精密度实验结果显示,批内变异＜10%,批间变异＜15%。ELISA方法测定的标本值与放射免疫检测符合性良好。结论:本研究对ELISA反应体系可能遇到的问题加以改良,对反应温度、时间均加以比较探索直至最合适,采用高纯度的抗体对板条进行包被,板条经过紫外照射,通过棋盘滴定法确定了抗原、抗体及酶的最佳工作浓度。灵敏度、回收率、批内变异、批间变异、稳定性及特异性等方法学评价指标均良好。同生物素间接包被相比较,后者会提供更加灵敏、及本底更好的方法,因此,本方法提供了临床上快速、准确、方便检测EPO的工具,很有发展前途。