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近年来非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的全球发病率逐年上升,且有患者逐渐年轻化的趋势。据报道,目前全世界约20%~30%的成年人可能患有NAFLD,其中大部分处于SFL阶段,且早期不会出现严重的症状或肝功能损害,因此并未得到足够的重视。而SFL患者中又有约1/5的人可能会在数年内进展成为NASH患者甚至肝硬化和肝癌。因此,NAFLD已成为一种对大众健康造成严重身心危害的常见病和多发病,各国政府和全社会对于该病的科研性和诊治性投入也不断增多。但目前尚无防治NAFLD的有效措施,这有赖于对该病发生机制的深入探索。既往研究提示SIRT3分子是肝脏脂肪代谢调控的重要分子,能够通过对一系列的底物去乙酰化修饰反应来参与调节肝脏细胞的脂肪酸氧化、氧化应激调节、线粒体功能改变以及炎症因子表达等生物学过程,这些过程均可能与NAFLD的发病及进展关系密切。本课题组长期从事糖尿病、脂肪肝等慢性代谢性疾病的营养干预方案研究,发现SIRT3是运动、卡路里限制和植物化合物等营养、运动干预方案的核心分子。为了找到SIRT3基因是否在人群脂肪肝发生的证据,我们选取SIRT3作为目的靶标基因,首先利用生物信息学方法分析SIRT3基因的连锁不平衡关系和基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点;然后建立NAFLD的人群研究队列,纳入384名NAFLD患者和384名正常对照者,分别提取其基因组DNA,并对SIRT3基因的13个SNP位点进行基因分型和关联分析,发现了SNP位点rs11246020,rs3782118和rs73392700与疾病风险存在关联。为进一步研究SIRT3功能获得(gain-of-function)如何影响NAFLD的疾病过程,我们利用长程高脂喂养方法成功构建NAFLD小鼠模型,构建了SIRT3真核表达质粒载体,采用转染试剂包装后用间断性尾静脉注射的方法成功诱导模型小鼠肝脏发生SIRT3基因的高表达,监测并分析动物膳食摄入和体重增长的关系,并采用相应的试剂盒检测小鼠肝脏和血液中脂质代谢相关的甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,CHO)和游离脂肪酸(free fat acid,FFA)等生化指标,同时采用肝脏HE染色、油红O染色观察肝细胞脂肪聚积等病理学变化,并提取蛋白和RNA,分别采用蛋白印迹和Real-time PCR等方法检测相关蛋白和脂肪酸代谢相关信号通路中Pparα、cpt1a、cpt1b和Acox1等基因的表达情况。主要结果如下:(1)SIRT3基因编码区SNP rs11246020的基因型分布在NAFLD和对照人群中分布有显著差异,GG基因型个体相对AG+AA基因型个体有风险增加的效应(OR=1.4,P=0.0427)。rs3782118和rs73392700不同等位基因型(allele)与NAFLD的发生风险相关(ORT/C-rs3782118=1.27,P=0.0361;ORC/G-rs73392700=1.45,P=0.0361)。(2)长程高脂膳食喂养可成功构建小鼠NAFLD模型,采用SIRT3基因质粒载体转染方法可成功将人源性的SIRT3基因转至模型小鼠肝脏内,并导致SIRT3蛋白在肝内的高表达;处理25天后SIRT3高表达组NAFLD模型小鼠的体重显著低于空载体组小鼠,被有效地控制在较低的水平;而空载体组小鼠的体重则呈持续上升的趋势,并稳定在较高的水平。(3)SIRT3基因治疗模型小鼠肝脏组织中的脂肪组织蓄积、细胞空泡样变性和脂肪样变的程度均显著低于空载体组,肝脏中TG、CHO、FFA的产生以及血清中FFA的水平也显著低于空载体组。SIRT3基因高表达后,肝脏中与脂代谢密切相关的基因Pparα及下游靶基因Acox1的转录显著下降。结论:(1)SIRT3基因多态性参与影响人群NAFLD发生风险。(2)SIRT3的基因获得效应(gain-of-function)对NAFLD模型小鼠肝脏脂肪积累表现出显著的改善作用。以上调SIRT3为靶标的NAFLD膳食营养方案可直接通过调节线粒体代谢改善NAFLD。