小麦氮高效主效QTL定位及候选基因功能研究

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小麦(Triticum aestivum)是我国的主要粮食作物之一,氮素是小麦生长发育必不可少的营养元素。缺氮使小麦穗数和穗粒数减少,叶片黄化,产量降低;施用氮肥才能使小麦获得高产。然而过度生产和施用氮肥不仅消耗大量的能源,还将造成生态环境的破坏。实现小麦节肥增产、减少氮肥对环境负面影响的关键是提高氮素利用率(nitrogen use efficiency,NUE)。提高小麦NUE可以在较低氮素水平下仍能得到较高的产量,从而减少氮肥消耗。本研究发现小麦材料178A和178B在低氮下的叶色以及农艺性状存在显著差异,并且在灌浆期呈现不同的旗叶衰老动态。在2014-2015和2015-2016年调查178A和178B的RIL系群体的开花期的旗叶叶色、灌浆期旗叶持绿时间(greenness persistence duration,GPD)以及收获后农艺性状表型,并定位控制小麦NUE和产量相关性状的数量性状遗传位点(quantitative traits locus,QTL)。对6A染色体定位到的控制GPD的位点qGPD-6A进行了精细定位,并进一步分析了候选基因的功能。获得的主要结果如下:  1.在低氮条件下,开花前178A叶片明显比178B叶片绿。苗期和拔节期采样分析表明,178A不同叶位的氮浓度均高于178B。在灌浆期,178B叶片表现早衰,178A叶片的持绿时间比178B长。与178B相比,178A在低氮条件下有较高的生物学产量、籽粒产量、穗粒数和收获指数,以及较低的千粒重;在高氮条件下,178A有较高的籽粒产量、穗数、穗粒数和收获指数,以及较低的千粒重。这些结果说明178A在减少供氮条件下仍然能保持较高的产量,可以高效利用氮素。  2.通过对“178A×178B”的480个RIL系的表型观察,定位到了6个控制低氮条件下开花期旗叶叶色的QTL位点(qLC),分别位于1A、1B、1D、5A、6A和7D染色体。其中位于1A染色体的qLC-1A为两年均能检测到的主效QTL。在1A、1B、2B、3B、4B和6A染色体上定位到控制灌浆期旗叶持绿时间的6个主效QTL位点(qGPD),其中,qGPD-1A与控制开花期的叶色的位点qLC-1A共定位。qGPD-6A为效应值最高并且两年均能检测到的主效QTL。  3.通过对“178A×178B”的480个RIL系在两年两个供氮水平共4个环境条件下的产量相关性状表型观察,最终定位到7个控制产量的QTL位点,9个控制穗数的QTL位点,12个控制穗粒数的QTL位点,8个控制千粒重的QTL位点;其中总共有9个位点在两个环境以上都能检测到。另外,定位到了9处控制两个或两个以上的性状的QTL簇,其中位于1A染色体的QTL簇包含了控制开花期叶色的qLC-1A和控制穗数的qSN-1A.15HN;位于6A染色体上的QTL簇包含了控制灌浆期旗叶持绿时间的主效位点qGPD-6A、控制单株产量的主效位点qGY-6A.15LN/15HN、控制穗数的位点qSN-6A.16LN和控制千粒重的位点qTGW-6A.15LN。  4.将控制灌浆期旗叶持绿时间的主效位点qGPD-6A定位到6A染色体76-77.5Mb的区间内,该区间内衰老调控相关TaNAM-A1基因可能为qGPD-6A的候选基因。与178B的TaNAM-A1基因序列相比,178A中该基因序列在第二个外显子区有1个SNP,导致编码氨基酸的改变;另外在靠近终止密码子处有1bp的缺失,可导致靠近C端的氨基酸编码的提前终止,因此将178A中的基因序列命名为突变型tanam-a1。  5.与178A和持绿的RIL系相比,Gene26-6A在178B和早衰的RIL系旗叶中的表达量较高。与178B相比,178A的Gene26-6A基因序列存在提前终止突变。通过酵母单杂交实验证明,TaNAM-A1可以与Gene26-6A的启动子结合,而tanam-a1则不能与Gene26-6A的启动子结合,表明178A和178B的TaNAM-A1的序列差异可导致其转录激活活性变化。  6.利用大麦(Hordeum vulgare)条纹花叶病毒诱导的基因沉默(BSMV-VIGS)技术减量表达TaNAM-A1和Gene26-6A可以减缓叶片衰老过程中叶绿素降解的速率,表明TaNAM-A1和Gene26-6A参与了叶片衰老进程的调控。  7.用小麦660K SNP芯片分析了220份国内小麦品种qGPD-6A区域的单倍型,结果显示,大多数小麦品种携有与178A一致的单倍型,越往南的省份的品种中携有与178B一致的单倍型的品种比例增加。除了山东和陕西两种单倍型的品种持绿时间没有差异以外,北京、河北、山西和河南省的qGPD-6A区域为178A类型的品种持绿时间比178B类型的品种长1-2d。  综合以上结果,我们定位了控制小麦开花期叶色的主效QTL qLC-1A、灌浆期叶片持绿时间的主效QTL qGPD-6A,同时还定位了不同供氮水平下产量性状的QTL,发现qLC-1A和qGPD-6A与一些产量性状的QTL共定位;精细定位了qGPD-6A并克隆了其候选基因TaNAM-A1。通过功能分析发现TaNAM-A1可以结合Gene26-6A的启动子,而突变型的tanam-a1则不能;TaNAM-A1和Gene26-6A均正调控了叶片的衰老。我国的绝大多数小麦品种中qGPD-6A区域单倍型与178A和178B一致,且有明显的地域分布规律。本研究发掘了影响小麦氮效率的主效位点的优良等位变异,为提高小麦氮素利用率实现节肥增产提供有价值的基因资源。
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