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研究背景:糖尿病是一种常见病和多发病,是由胰岛素分泌相对或绝对不足引起的,以血糖升高为主要特征。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素,并可促进糖原、蛋白质、脂肪合成。外源性胰岛素是治疗糖尿病的主要方法,具有起效快、效果明显等优点,但胰岛素反复注射会给患者带来心理压力及身体痛苦,如:疼痛、注射部位出血、脂肪变性等,还可能引起高胰岛素血症,使病人出现低血糖、昏迷乃至休克。开发非注射剂型的胰岛素成为糖尿病治疗的热点问题。口腔中的颊黏膜和舌下黏膜含有丰富的血管,且蛋白水解酶浓度含量较低,药物可经黏膜下的血管到达全身,且给药方便,为胰岛素非注射给药提供一个新途径。本课题组前期设计了穿膜肽-胰岛素原融合蛋白(p Insulin)。p Insulin可在穿膜肽的引导下穿透皮肤或黏膜。p Insulin含有弗林蛋白酶(furin)的酶切位点,进入组织后可在furin的作用下剪去C肽,加工为成熟胰岛素,发挥其降血糖作用。研究目的:制备p Insulin胰岛素,研究其降血糖效果,评价其安全性,为p Insulin胰岛素的进一步开发应用提供理论依据。研究方法:利用大肠杆菌原核表达系统制备p Insulin蛋白;利用镍柱亲和层析、脉冲稀释复性等方法纯化p Insulin蛋白;利用甘露醇作为辅料制备p Insulin冻干粉剂。利用小鼠血糖法测定p Insulin的生物学效价;利用腹腔注射STZ的方法建立糖尿病小鼠模型;利用体内药效学实验评价p Insulin胰岛素经腹腔注射方式/舌下黏膜给药方式的降血糖效果及储存温度对其药效学稳定性的影响;利用急性毒性实验、亚慢性毒性实验(90天)初步评价p Insulin的一般毒性。研究结果:1.pInsulin样品制备及生物学效价测定利用大肠杆菌原核表达系统表达p Insulin蛋白,通过镍柱亲和层析技术获得有活性的纯化样品;使用脉冲稀释复性的方式成功复性,每升发酵液可获得20-40 mg的p Insulin。以甘露醇作为辅料,成功制备p Insulin冻干粉样品,易于保存、便携。通过小鼠血糖法标定p Insulin的生物学效价为13.15 IU/mg。2.p Insulin的药效学实验使用STZ制备ICR小鼠的糖尿病模型。按4.5 IU/Kg腹腔注射p Insulin后能明显降低糖尿病模型小鼠的血糖。给药1h后,血糖降至正常范围。按4.5 IU/Kg体重腹腔注射市售第三代重组人胰岛素(优泌乐R25)的血糖曲线上面积(AAC)为2821.4±114.8,腹腔注射4.5 IU/Kg p Insulin,其AAC为2761.2±111.8,二者不具有统计学差异(P>0.05)。表明:腹腔注射给药,p Insulin与优泌乐R25具有类似的降糖效果。经舌下黏膜给予糖尿病模型小鼠150 IU/Kg pInsulin,给药2h后,血糖降至给药前的1/3。相同条件给予优泌乐R25降糖效果不明显。以腹腔注射优泌乐R25作为参照,优泌乐R25舌下黏膜给药的AAC为299±91.11,药理相对生物利用度为0.32%,p Insulin舌下黏膜给药的AAC为2282.5±181.13,药理相对生物利用度为2.43%,是优泌乐R25的7.6倍。表明:舌下黏膜给药时p Insulin比优泌乐R25更易被吸收利用。药效学稳定性实验结果显示:与对照组相比(实验当天配制的p Insulin溶液),4℃保存的p Insulin降糖效果不受影响。储存于25℃和37℃的p Insulin降糖效果明显降低(P<0.05)。提示:p Insulin应在低温(4℃)条件下储存。3.p Insulin的急性毒性实验使用最大给药量法评价pInsulin胰岛素的急性毒性。按131.5 IU/Kg皮下注射给予实验大鼠p Insulin,15 min后,实验组动物开始出现精神萎靡,活动度下降,随时间增加,部分动物逐渐发展为四肢抽搐,全身肌肉痉挛,嗜睡,体温降低等症状。给药后2 h,实验动物开始死亡,所有死亡动物均出现在给药后8 h内。其中,雌鼠死亡2只,雄鼠3只。表明:p Insulin的半数致死剂量大于131.5IU/Kg体重,相当于临床等效剂量的41倍。解剖死亡的实验动物,未观察到心、肝、脾、肺、肾、脑等重要器官有明显改变,实验动物死亡可能由于胰岛素量大引起。给药两周后处死全部实验动物,处死前大鼠状况良好,解剖未见心、肝、脾、肺、肾、脑等器官有异常,脏器系数同对照组比无显著性差异。4.p Insulin的亚慢性毒性实验90天给药期间,各组大鼠体重持续增长。各实验组动物体重与对照组相比未见明显的统计学差异。处死前大鼠精神状况良好,活动正常。解剖可见:大鼠胸膜、腹膜光滑,胸腔和腹腔内均未发现明显的积液和粘连。小部分动物有肺组织变性,脾脏有轻微红肿,发生率无明显剂量反应关系。高剂量组部分动物肝脏有红肿。其余心、肾、脑等器官形态、颜色、位置未见明显异常。高剂量组肝的脏器系数与溶剂对照组相比显著性增高(P<0.05),其余各器官的脏器系数未见异常。进一步HE染色结果发现:大部分组织结构正常。小部分动物出现肺泡上皮不同程度萎缩、大小不等,肺泡间隔增宽、红细胞渗出、慢性炎细胞浸润,局部肺纤维化等改变,病变发生率无明显的剂量-反应关系。小部分脾组织有充血、含铁血黄素沉积现象,病变发生率无明显的剂量-反应关系。高剂量组部分肝脏有细胞水肿,但肝小叶结构正常,肝细胞索清晰。高剂量组部分心脏切片中,发现了局部血管扩张充血,但未发现明显的心肌细胞变性坏死和炎细胞浸润。血生化检验结果显示:除雄鼠高剂量组的ALT/AST、雌鼠中剂量组尿素有显著性差异之外,其余指标均无统计学差异。结论:1.成功制备了p Insulin融合蛋白,其生物学效价为13.15 IU/mg,可信限率为19.36%。2.p Insulin以腹腔注射/舌下黏膜方式给药时均具有良好的降血糖效果。3.p Insulin的半数致死剂量大于131.5 IU/Kg,相当于临床等效剂量的41倍。4.亚慢性毒性实验表明,p Insulin的未观察到有害作用水平(No Observed Adverse Effect Level,NOAEL)为6.4 IU/Kg,为临床等效剂量的2倍。