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本文利用PCR、原核表达、蛋白纯化、细胞培养、细胞转染、免疫荧光、CCK-8细胞活力检测、激光共聚焦、流式细胞术、Western blot等细胞生物学及分子生物学技术和方法,成功完成了鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)B淋巴细胞刺激因子(ScBAFF)及γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶(ScGILT)的克隆、表达和生物学活性的研究。实验结果如下:1.ScBAFF的克隆、表达和生物学活性鉴定BAFF是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的重要成员,对B淋巴细胞的成熟、分化及存活具有重要作用。本课题首次从鲢鱼脾脏中克隆得到了 BAFF同源基因鲢鱼BAFF(ScBAFF),结果显示,ScBAFF基因ORF全长804 bp,编码267个氨基酸,其中胞外可溶区包含157个氨基酸。氨基酸序列分析显示,ScBAFF蛋白结构具有跨膜结构域,与其他物种BAFF蛋白类似,是典型的Ⅱ型跨膜蛋白;氨基酸序列比对及蛋白结构预测结果显示,ScBAFF蛋白与其他物种BAFF蛋白同源性较高,空间结构非常相似;组织表达分析显示,ScBAFF主要在鲢鱼免疫器官脾脏及头肾中表达。通过构建融合表达载体,我们成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并用镍柱纯化了重组蛋白His6-ScsBAFF,并进行了 SDS-PAGE及Western blot鉴定。生物活性检测显示,在体外,His6-ScsBAFF蛋白能够与人正常淋巴细胞及人B淋巴瘤细胞Raji表面受体结合,并能促进这两类细胞增殖及存活。这些结果暗示ScBAFF可能在鲢鱼的免疫系统中具有重要的作用,或许能够为鲢鱼免疫系统的研究提供理论依据。2.ScGILT的克隆、表达和生物学活性鉴定GILT对MHC Ⅱ类途径(外源性抗原加工途径)中抗原加工和呈递过程中的二硫键的还原起着重要作用。本实验成功克隆出鲢鱼GILT(ScGILT)全长CDS序列,结果显示,ScGILT基因ORF全长771 bp,编码256个氨基酸,序列分析显示ScGILT氨基酸序列拥有GILT的主要特征,包括CXXC活性基序,CQHGX2ECX2 NX4C序列,糖基化位点NVT以及C端存在6个保守的半胱氨酸残基。组织表达分析显示,GILT的表达具有组织特异性,经LPS刺激后,脾细胞及头肾细胞中ScGILT mRNA的表达量明显上调。我们成功构建了融合表达载体pET28a-ScGILT并在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了重组蛋白His6-ScGILT,对其进行了 SDS-PAGE及Western blot鉴定。生物活性检测显示,His6-ScGILT能够还原人IgG蛋白中的二硫键,具有疏基还原酶活性。最后,通过细胞转染及免疫荧光技术,我们分析了 ScGILT的细胞亚定位,发现经LPS刺激后,ScGILT蛋白与LAMP1蛋白(溶酶体标志性蛋白)在细胞中的定位有很大程度上的重合。以上结果暗示ScGILT可能在鲢鱼对细菌入侵的免疫反应中发挥重要的作用。