玉米(Zea mays L.)是世界第三大作物,是重要的粮食作物和饲料作物,也是现代食品、医药和化学工业的重要原料。然而,生产上玉米病害一直是影响玉米产量的重要限制因素,传统的常规育种由于抗源的缺乏和不同物种间的遗传隔离,使抗病育种工作受到了极大的限制。利用基因工程技术进行玉米遗传改良,增强玉米抗病虫和耐逆境能力,提高产量,改善品质,是玉米遗传育种的一个新方向。近年来,玉米转基因抗虫、抗除草剂的研究较多,但转基因抗玉米矮花叶病毒(maize dwarf mosaic virus,MDMV)病的报道较少。玉米矮花叶病是一种世界性病害,在世界范围内发生。目前确定引起我国MDMV病的病原主要有MDMV-B株系(SCMV)、高粱花叶病毒(SrMV)和白草花叶病毒(PenMV)。植物抗病毒基因工程策略有多种,前人研究表明利用RNAi原理介导的抗病性特异性强,较易获得高抗甚至免疫的转基因植株,为作物抗病毒基因工程提供了更有效的途径。本研究对农杆菌介导的玉米转化PenMV、SCMV基因进行系统研究,以期获得抗玉米矮花叶病毒的转基因玉米。为建立玉米自交系的再生体系和遗传转化体系,探讨RNAi技术在抗玉米矮花叶病毒基因工程中的应用效果,本研究以生产上常用的玉米自交系E28、旅9、478、黄早4、9801、豫12、齐319、黄C等22份为试验材料,通过幼胚胚性愈伤组织诱导及再生植株分化比较,研究影响胚性愈伤组织形成及植株分化的因素(基因型、培养基激素组成、幼胚大小、接种方式、继代次数等);利用SSR技术研究玉米幼胚培养能力与遗传基础的关系,建立幼胚培养特性的评价体系。根据RNAi原理构建了玉米矮花叶病毒基因(PenMV HC-Pro和SCMV CI)反向重复序列表达载体,以E28、旅9、齐319等的胚性愈伤组织为材料,采用农杆菌介导将PenMV HC-Pro基因和SCMV CI基因的反向重复序列转入玉米自交系,系统研究了影响遗传转化的主要因素(农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间、共培养温度、负压处理、超声波处理、继代次数等)。获得的主要结果如下:1.构建了玉米矮花叶病毒基因(PenMV HC和SCMV CI)反向重复序列表达载体。对PenMV- B的HC基因与PenMV-C的HC基因进行同源性分析,确定HC基因的保守片段;对SCMV-BJ的CI基因与SCMV-ZJ、SCMV-SX、SCMV-SD的CI基因同源性比较,确定CI基因的保守片段。分别根据保守序列设计引物,以PenMV HC-Pro基因和SCMV CI基因的cDNA为模板, PCR扩增能形成“发夹结构”的正反向片段,连接后插入到质粒载体pCAMBIA3301。通过冻融法将载体直接导入农杆菌中,用于农杆菌介导的玉米转化。2.建立了玉米自交系受体系统。以E28、旅9、齐319、黄早4、478、昌7-2、黄C、7922等22份自交系为试材,以胚性愈伤组织诱导率和再生植株分化率为评价指标,对幼胚大小、接种方式、基因型、培养基激素组成、继代次数、AgNO3浓度等影响因素进行优化。结果表明基因型、幼胚大小、继代次数、AgNO3浓度等是玉米幼胚培养胚性愈伤组织诱导和植株再生的重要影响因素。在N6培养基的基础上,添加3mg/L 2,4-D、0.2mg/L IAA和8～12mg/L AgNO3利于诱导胚性愈伤组织;添加1mg/L KT和0.5mg/L IBA利于诱导再生植株分化和生根;一般愈伤组织继代5～7次可以调整到较佳状态,其胚性率和植株分化率都较高。筛选再生植株分化率较高的基因型有E28、旅9、齐319、黄早4、502,胚性愈伤组织诱导率最高达83.5%,分化率可达80%。3.建立了预测评价玉米自交系幼胚培养特性的分子评价体系。利用22份玉米自交系对30对多态性较好SSR引物进一步筛选,获得14对多态性引物(mmc0022,bnlg1671, phi308707,phi96100,umc1165, bnlg1018,phi090,phi37418, umc1122, mmc0071,umc1359,phi080,bnlg1538,phi015)对22份材料进行遗传关系聚类。结果表明遗传聚类结果与胚性愈伤组织诱导率、再生植株分化率聚类结果的吻合度平均达88%,表明遗传基础关系较近的材料,其幼胚培养能力也有相似性,利用选出的14对SSR引物可以较可靠评价选择玉米自交系的幼胚培养能力。这为快速评价玉米自交系幼胚培养能力提供了分子依据。4.建立了玉米自交系胚性愈伤组织的遗传转化体系。以E28、旅9、齐319等的胚性愈伤组织为受体,转化表达载体p3301HCIR,研究了农杆菌菌株(LBA4404和EHA105)、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、负压处理、超声波处理、乙酰丁香酮(AS)、筛选方式等因素对玉米转化的影响。结果表明:菌株LBA4404,共培养培养基和感染液中加入100μg/L的AS,菌液浓度OD600=0.5～0.7,侵染时间20～25min(辅助负压处理10min),25℃共培养3d,PPT为5、10、5mg/L进行三次筛选获得抗性愈伤组织频率最高,达20.2%。菌液浓度、侵染时间和共培养时间3个因素之间相互作用,共同影响转化效果,其中重要的因素是菌液浓度和侵染时间。获得18株PCR检测呈阳性的转基因植株, E28转化获得5株、齐319转化获得11株、旅9获得2株。3种基因型中,齐319对农杆菌侵染力较强,获得的抗性愈伤组织频率和转化苗最多,适合作为今后玉米遗传转化良好的受体。初步建立了较为优化的农杆菌介导玉米胚性愈伤组织遗传转化体系。5.转PenMV HC-Pro反向重复片段玉米的检测与遗传分析。18株PCR检测呈阳性的转基因植株,对其中生长健壮的9株进行Southern杂交检测分析,8株呈阳性(6株单拷贝,2株双拷贝),证明单拷贝形式整合到玉米基因组不同位点的频率为66.7%。其中4株(齐319有2株,E28有2株)正常可育,形成转基因株系。经PCR对T1代株系检测,外源基因在T1代中的分离呈现多样性,其中3个株系(Q1、Q2、E2)外源基因按照孟德尔3:1分离进行遗传,株行E1外源基因的遗传不符合孟德尔分离规律。经PenMV人工接种病毒鉴定,转基因后代表现不同程度的病毒抗性,为今后玉米抗病育种提供新的种质资源。6.农杆菌介导的转化SCMV CI反向重复片段转基因植株的获得。按照建立的农杆菌介导的遗传转化体系,以E28的胚性愈伤组织为受体转化SCMV CI反向重复片段,获得抗性苗32株,经PCR和PCR-Southern杂交检测,其中5株均呈阳性。初步证明SCMV CI基因反向重复片段整合到玉米基因组中,总体转化率为1.25%。证明本研究建立的农杆菌介导的玉米遗传转化体系具有可行性,为今后利用基因工程进行玉米遗传改良奠定基础。