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烟曲霉是自然界广泛存在的真菌,可以引起免疫功能低下患者的严重机会感染。近20年来,随着造血干细胞移植(Hematopoietic Stem Cell Transplantation,HSCT)技术的快速发展,造血干细胞移植的患者越来越多,而造血干细胞移植患者伴随感染的机会也明显增高。恶性肿瘤、粒细胞减少或功能障碍、糖皮质类固醇和免疫抑制剂的使用等原因造成的患者免疫功能缺陷,导致侵袭性曲霉病发病率不断上升。目前造血干细胞移植患者免疫功能抑制而感染侵袭性曲霉病是造血干细胞移植后死亡的主要原因。中性粒细胞(PMN)是机体防御系统的重要组成部分,它通过吞噬等方式来抵御和消灭入侵的病原微生物,与机体的非特异性抗感染过程有关,该类细胞具有强大的吞噬杀菌功能,其作用过程历经趋化运动,识别并结合吞噬物质,进而摄入胞内,最终杀伤并降解病原体。烟曲霉的代谢产物(Af D)可通过抑制免疫反应或破坏局部组织从而导致人及动物的侵袭性曲霉病。而对于免疫功能正常的人来说,吞噬的烟曲霉菌易被PMN细胞杀灭并清除。但关于造血干细胞移植后患者中性粒细胞的功能、对曲霉菌的吞噬作用改变及机制尚未完全清楚。因此本论文以健康人和造血干细胞移植患者(4-6周)外周血PMN细胞为研究对象,在体外培养条件下给予烟曲霉孢子及其代谢产物在刺激后,分别应用光镜、电镜技术观察中性粒细胞的形态学、流式细胞仪检测中性粒细胞体积大小、呼吸爆发产生超氧离子(O2-)水平、中性粒细胞表面CD64表达水平及其吞噬率和吞噬指数的改变,探讨造血干细胞移植患者PMN对烟曲霉和其代谢产物混合作用的反应性,初步探讨造血干细胞移植患者易患烟曲霉病的可能机制。首先利用新方法分离和纯化外周血健康人和造血干细胞移植患者的PMN,经姬姆萨染液染色后确认可制得纯度>95%的PMN细胞。台盼蓝排斥法测PMN细胞活性>98%。光镜下我们发现健康人的PMN细胞核呈杆状或2~5分叶状,叶与叶间有细丝相连,造血干细胞移植患者中性粒细胞胞浆核增大,中幼至分叶核嗜酸性粒细胞部分明显增大;通过扫描电镜发现健康人PMN细胞体积大小基本相同,造血干细胞移植患者PMN细胞体积大小有差异,其细胞平均体积比健康人大,这与流式细胞技术检测PMN细胞体积大小结果相符。上述结果说明造血干细胞移植患者血液中的PMN多以不成熟的幼稚状态存在。接下来将烟曲霉孢子及代谢产物与分离所得的高纯度中PMN细胞共同孵育2小时,然后利用PAS(Periodic Acid-Schiff)染色、电镜技术和流式细胞术观察中性粒细胞的形态学变化与吞噬功能的关系。加入孢子混合液(烟曲霉孢子+Af D)刺激PMN2小时后透射电镜下我们发现健康人PMN细胞对烟曲霉孢子的吞噬率和吞噬指数在Af D存在与不存在的情况下无明显改变,但造血干细胞移植患者PMN同时粘附和吞噬孢子数比健康人少,线粒体肿胀明显,内质网扩张,并可见部分胞质内局灶性坏死;更为显著的是PAS染色后也发现Af D可以显著抑制造血干细胞移植患者PMN细胞对烟曲霉孢子的吞噬率和吞噬指数;通过流式细胞术检测PMN细胞内含有CFSE标记的烟曲霉孢子的数量进一步证实了Af D抑制HSCT患者PMN细胞吞噬烟曲霉孢子能力的影响。为了进一步探索影响造血干细胞移植患者PMN细胞吞噬功能改变的可能机制,我们通过运用流式细胞仪检测PMN细胞活性氧分析呼吸爆发产生O2-水平;通过流式细胞术检测其表面CD64表达水平分析中性粒细胞抗感染能力。流式检测结果显示造血干细胞移植患者PMN经孢子混合液(烟曲霉孢子+Af D)刺激后PMN呼吸爆发产生O2-水平明显低于健康人群,而且Af D对造血干细胞移植患者PMN细胞O2-产生的抑制作用显著高于健康人PMN。我们推测Af D的细胞毒素所致的O2-产生水平的下降可能与造血干细胞移植患者PMN抗烟曲霉菌的能力降低密切相关。造血干细胞移植患者PMN表面CD64表达在烟曲霉孢子+Af D刺激前后期表达无明显变化,但造血干细胞移植患者PMN细胞CD64本底表达水平显著低于健康人PMN细胞,这可能与HSCT中性粒细胞呼吸爆发水平降低有关。通过以上实验研究,我们推测造血干细胞移植患者PMN细胞对易感烟曲霉菌与其吞噬功能的降低及其PMN细胞呼吸爆发产生低水平O2-和其本身CD64呈低水平表达密切相关;Af D显著抑制造血干细胞移植患者PMN细胞的吞噬功能、活性氧产生;且进一步证明了健康人和造血干细胞移植患者的中性粒细胞形态与结构的变化和其功能变化的相关性,但关于Af D对造血干细胞移植患者PMN细胞吞噬功能影响的具体机制仍需要进一步探讨。