急性肝衰竭(Acute hepatic failure,AHF)是指由肝炎病毒感染、药物中毒等各种原因导致短时间内肝脏细胞大面积坏死,进而使肝脏合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生障碍或失代偿,出现以黄疸、腹水、肝性脑病等肝功能严重障碍而导致的临床综合征。据统计我国每年此类患者高达20～30万,AHF发病急,病程进展快,死亡率可高达80%以上,因此国内外学者都在积极探索寻找有效的治疗方法。肝移植尽管是有效的治疗手段,但是随着肝脏疾病发病率的升高,供肝的来源远远跟不上患者的需求,同时肝移植的治疗费用昂贵等系列因素限制了其临床的应用;生物人工肝(Bioartificial Liver,BAL)能有效的改善肝功能状况,但由于肝细胞来源局限以及生物安全性等因素困扰,其在临床上的应用也受到了限制;20世纪90年代以来兴起的干细胞技术日渐成熟,成为生命科学领域的研究热点,肝细胞移植、骨髓间充质干细胞移植等替代治疗成为近年来研究的热点,有望成为治疗急性肝衰竭的实用方法。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)是一类具有自我复制功能和分化潜能的早期未分化细胞,属于成体干细胞的一种,具有很强的可塑性,可以跨越胚层横向分化为肝样细胞等多种组织细胞,且具备取材方便、体外培养技术成熟以及自体移植等优点,因此其有望成为组织工程和细胞治疗的理想种子细胞。如何高效诱导BMSCs向肝样细胞分化,是干细胞移植等应用于临床肝脏疾病治疗的关键,但由于其具体的分化机制尚未明确,这一关键问题尚未得到满意解决,临床应用也远未达到预期效果。因此探究BMSCs向肝样细胞分化的分子机制意义重大。BMSCs向肝样细胞分化的事实已经得到了多数实验的证实,但其具体的分化机制尚存在争议。目前主要观点有:(1)横向分化学说:BMSCs本身具有多向分化潜能,可以分化为肝样细胞;(2)细胞融合学说:BMSCs首先与宿主肝细胞融合,然后进一步分化为肝样细胞。由于许多干细胞分化实验并未发现细胞融合的现象,故目前多数学者更支持横向分化学说,然而BMSCs横向分化的具体调控机制仍不清楚。BMSCs向肝样细胞分化的研究内容主要分为体外、体内研究两个方面。体外分化研究主要聚焦在采用不同的生长因子、使用不同的培养基、与肝实质细胞或非实质细胞共培养等进行定向诱导分化。细胞生长因子在BMSCs诱导分化过程中起了极为重要的作用,因而自然成为研究的一大热点。肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)已被证实其不仅能诱导肝干细胞向肝样细胞归巢,也能诱导纯化的白蛋白阴性肝干细胞向白蛋白阳性的肝干细胞转化。同时研究发现肝细胞生长因子可通过激活磷脂肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路促进BMSCs向肝样细胞分化。体内分化研究发现,纯化后的BMSCs可在体内转化为肝前体细胞或肝样细胞,并能拥有肝细胞合成、解毒、代谢等部分功能。目前所有的研究结果并未证实体外诱导分化实验中发现的各种细胞因子如HGF、FGF-4等在生理病理条件下能否在体内诱导BMSCs向肝样细胞定向分化;体内实验也仅仅证实肝脏微环境中可能存在某些促使BMSCs定向分化为肝样细胞的物质;临床上虽然发现肝衰竭及肝功能障碍等患者可通过自体移植的BMSCs在肝内特定的微环境促进其向有功能的肝样细胞定向分化,从而改善患者的肝功能,延长其生存期,但该治疗方法的具体作用机制并不明确。目前尚未从“全景范围”内对BMSCs向肝样细胞分化过程的微环境进行深入研究。目前研究已经证实干细胞生存的微环境直接影响与决定着其向成体干细胞的分化方向。因此越来越多的学者将微环境的研究作为各类干细胞定向分化机制研究的突破口和切入点。干细胞定向分化过程中所处的局部微环境包括各种细胞因子、基质细胞与细胞外基质等众多蛋白、细胞因子,探索这些物质的功能和作用机制是极其复杂,而同位素相对标记和绝对定量蛋白质组学(Isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)具有规模大、高通量、高灵敏等优点,与基因组学、生物信息学互相渗透、相互补充,可用于研究极其复杂的多种细胞因子和蛋白质变化。因此,iTRAQ蛋白质组学是干细胞生物学研究的一项非常重要的实验技术。它可对一个特定细胞基因组表达的所有蛋白质进行质量和数量分析,可确定全部蛋白质表达谱,依托高效质谱分析体系及生物信息学,可以寻找其中的关键蛋白分子,并研究生物分子之间的相互作用。而且生物信息学的发展为蛋白质组的研究提供了方便有效的计算机分析软件,使该方法具有快速、直观的优点。总之,目前对BMSCs向肝样细胞分化的机制比较一致的看法是:BMSCs在微环境因素诱导下,通过一系列的信号传导通路选择性的抑制或激活相关转录因子,从而启动相应的关键基因,进而出现特定的转录和翻译,导致细胞内特异性蛋白合成并产生相应的生物学效应,从而使分化后的细胞在生化、结构和功能上发生变化。在此分化过程中,微环境中某些蛋白起到了关键的启动作用。因此,对微环境中蛋白分子的研究有助于初步阐明BMSCs定向分化为肝样细胞的分子机制。本课题在建立大鼠急性肝衰竭模型基础上,采用iTRAQ蛋白质组学技术检测大鼠急性肝衰竭模型组与对照组不同时间点肝脏蛋白质组的表达差异,并通过生物信息学方法从上述差异蛋白中筛选出BMSCs诱导分化过程中可能起作用的“关键”蛋白,并将该“关键”蛋白加入体外培养的BMSCs中,通过体外实验探寻该蛋白诱导BMSCs向肝样细胞转化的效率,以便更深入地阐明骨BMSCs向肝样细胞定向分化的相关机制。第一章大鼠急性肝衰竭模型的建立目的:通过D-氨基半乳糖联合脂多糖建立大鼠急性肝衰竭模型。方法:SD大鼠69只,按随机数字法分为四组:正常对照组9只、24h组20只、48h组20只、72h组20只。实验组SD大鼠腹腔内注射0.1mg/ml D-氨基半乳糖700mg/kg及浓度为1μg/ml的脂多糖5μg/kg诱导大鼠急性肝衰竭,对照组SD大鼠腹腔内注射等体积0.9%氯化钠。观察4组SD大鼠的一般情况,分别测定24h、48h、72h不同时段大鼠肝功能变化,并检查相应时段大鼠肝脏大体及病理学变化。结果:采用D-氨基半乳糖联合脂多糖成功建立大鼠急性肝衰竭模型;实验组SD大鼠给药24h后出现反应迟钝、行动迟缓、饮食减少、尿色发黄,48h、72h开始出现明显的肝衰竭表现,对照组SD大鼠72h内未出现上述症状;与对照组比较,实验组大鼠肝功能各个时段的AST、TBiL、ALB、PL及NH3均出现显著的改变(P<0.05);随着造模药物作用的时间延长,大鼠的肝功能逐渐出现恶化。4组AST比较结果发现24h、48h、72h组与对照组比较有显著差异(F=40.360、P=0.000);4组TBiL比较结果发现存在显著性差异(F=61.269、P=0.000),48h组、72h组与24h组比较发现TBiL显著升高(P<0.05),差异有统计学意义;ALB四组具有显著性差异(F=81.336、P=0.000),48h、72h组与24h组比较随着时间的延长,ALB显著下降,有统计学意义(P<0.05)。说明随着药物作用时间的延长,肝脏合成功能急剧恶化;4组实验结果中PT四组比较均有统计学差异(F=216.335,P=0.000),24h、48h及72h组三组PT时间显著延长,与对照组比较存在统计学(P<0.05);4组大鼠NH3均有统计学差异(F=389.194,P=0.000),其中24h、48h及72h组与对照组比较有显著统计学差异。肝脏大体观察发现实验组大鼠肝包膜紧张无光泽,肝脏呈紫黑色,部分大鼠肝脏萎缩,肝包膜下可见大片状出血,肝脏质地脆,触之易出血,肝脏表面见大片颗粒样改变。病理检查发现实验组大鼠肝细胞出现明显水肿变性,肝窦扩张,有淋巴细胞、中性粒细胞等炎性细胞浸润;72h时镜下见肝窦扩张,呈网眼状,其内可见瘀血及出血,坏死灶可见细胞碎片,严重处小叶中心带呈带状坏死,部分坏死灶与邻近的中央带或周边带相连,构成桥接坏死,大鼠肝脏病理学改变符合典型的急性肝衰竭。结论:1.本实验采用D-氨基半乳糖联合脂多糖成功建立大鼠急性肝衰竭模型。2.采用D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导大鼠急性肝衰竭模型是建立急性肝衰竭动物模型较为理想的方法之一。第二章iTRAQ蛋白质组学技术筛选急性肝衰竭大鼠肝脏差异蛋白质的表达目的:通过同位素相对标记与绝对定量蛋白质组学技术(iTRAQ)鉴定24h、48h、72h急性肝衰竭组和对照组大鼠肝脏的差异表达蛋白质,并通过免疫组化及免疫印迹进一步验证iTRAQ蛋白质组学结果。方法:根据时间点不同共分为对照组、24h组、48h组及72h组,采用iTRAQ蛋白质组学技术鉴定4组大鼠肝脏组织差异蛋白质的表达,并通过生物信息学分析这些差异表达蛋白质的意义;采用免疫组化及免疫印迹进一步验证通过蛋白质组学鉴定出来的差异表达蛋白质谷胱甘肽-S-转移酶1(MGST1)及凝血酶敏感蛋白1(TSP1)。结果:通过iTRAQ蛋白质组学技术共鉴定出4组肝脏组织3106个蛋白质,各个通道皆有定量信息的蛋白为2820个。按照2个或更多的肽段具有高可信度(>95%)、差异倍数>1.5或<0.66且P<0.05的标准筛选差异蛋白,4组肝脏中共发现68个表达下调蛋白,73个表达上调蛋白。免疫组化结果发现对照组肝组织MGST1呈强阳性表达,对照组、24h、48h及72h组4组之间存在统计学差异(F=13.323,P=0.000),24h、48h及72h组与对照组比较存在显著差异(P<0.05);TSP1 4组之间存在统计学差异(F=5.375,P=0.009),48h及72h组与对照组比较存在统计学差异(P<0.05)。免疫印迹结果表明24h、48h及72h组MGST1表达显著下调,对照组、24h、48h及72h 4组之间存在统计学差异(F=155.426,P=0.000),48h、72h组与24h组比较亦有统计学差异(P<0.05);4组TSP1表达存在统计学差异(F=123.200,P=0.000),48h、72h组与对照组、24h组比较有显著统计学差异(P<0.005)。验证的MGST1、TSP1这两个差异表达蛋白变化趋势与iTRAQ蛋白质组学结果是相一致的。经过生物信息学分析差异表达的蛋白质获得了半乳糖凝集素-3、凝血酶敏感蛋白1、S100A9等可能参与骨髓干细胞的诱导分化过程。结论:1.在急性肝衰竭大鼠肝脏组织4组样品中共鉴定3106种蛋白质,并筛选出大鼠急性肝衰竭不同时段的差异表达蛋白141个,其中68个蛋白表达下调,73个蛋白表达上调;2.经过生物信息学分析获得了半乳糖凝集素-3、凝血酶敏感蛋白1、S100A9等多个可能与BMSCs向肝样细胞诱导分化相关的差异表达蛋白,可能成为新的潜在诱导因子;3.免疫组化及免疫印迹结果证明iTRAQ蛋白质组学技术在鉴定急性肝衰竭大鼠肝脏差异表达的蛋白质是敏感且准确的。第三章半乳糖凝集素-3诱导大鼠BMSCs向肝样细胞分化目的:体外研究半乳糖凝集素-3(Galectin-3、Gal-3)对大鼠BMSCs向肝样细胞诱导分化的作用,为BMSCs在肝脏疾病的基础研究及临床应用提供实验基础。方法:密度梯度离心法分离纯化SD大鼠BMSCs,然后分别加入0μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μ/ml的 Gal-3 联合 20ng/ml HGF,体外诱导培养28d。分别于7、14、21、28d时段进行细胞形态学观察,免疫荧光染色检测 AFP、CK-18 及 ALB 的表达,Q-PCR 检测 AFP、CK-18 及 ALB mRNA 基因表达情况;根据上述实验结果,追加0.5μg/ml Gal-3实验组,体外诱导培养28d,如上所述分别于7、14、21、28d进行相应检测。结果:倒置显微镜观察到分组诱导培养后,BMSCs形态逐渐向肝样细胞转化,与大鼠原代肝脏细胞IAR20相似,其中28d时间段,0.5μg/ml+20ng/ml HGF诱导培养组转化成IAR20相似细胞比例最高。各处理组在诱导分化后7d、14d、21d及28d进行免疫荧光细胞化学染色,结果发现与阳性对照组(大鼠IAR20肝脏细胞)比较,随着培养时间的延长,各组AFP、CK-18及ALB荧光染色阳性率明显增高,并且在28d时间点0.5μg/ml+20ng/ml HGF组AFP、CK-18及ALB的荧光染色阳性率;通过检测不同时段各组培养细胞的AFP、CK-18及ALB的mRNA表达检测,发现AFP、CK-18及ALB的mRNA表达不同浓度的Gal-3+HGF与诱导培养时间之间存在交互效应(F值分别为749.082、130.386、60.470,P=0.000);随着时间的延长,7d、14d、21d 及 28d 时段间 AFP、CK-18及ALB的mRNA表达存在显著差异(F值分别为1213.111、467.772、85.653,P=0.000),同时不同浓度的Gal-3联合HGF诱导骨髓干细胞表达AFP、CK-18及 ALB 亦存在显著差异(F值为 1349.676、133.476、242.839,P=0.000)。通过分析发现随着培养时间的延长,各组AFP、CK-18及ALB mRNA表达明显增加,同时以28d时间点表达量达到峰值;且28d时,0.5μg/ml Gal-3+20ng/ml HGF诱导组AFP、CK-18及ALB的mRNA表达量最高。追加的0.5μg/ml Gal-3实验组在BMSCs培养28d后,实验结果亦出现如前所述的变化趋势。结论:1.大鼠BMSCs具有向肝样细胞分化的潜能;2.Gal-3联合HGF、Gal-3均能诱导大鼠BMSCs分化为肝样细胞,分化后的肝样细胞能分泌肝细胞特异性产物AFP、ALB、CK18等;3.不同时段的Gal-3+HGF、Gal-3诱导BMSCS分化为肝样细胞的阳性率不同时,随诱导时间的延长,阳性转化率越高;4.不同浓度的Gal-3+HGF诱导BMSCs分化为肝样细胞的能力不同,28d时段以0.5 μg/ml Gal-3+20ng/ml HGF联合诱导分化BMSCS的阳性率最高;5.单独的0.5μg/ml Gal-3亦能高效的诱导大鼠BMSCs向肝样细胞分化,并分泌肝细胞特异性产物AFP、ALB、CK18 等。