研究背景伴随人口老龄化与生活方式的改变,在我国椎间盘突出症的发病率明显升高,成为我国主要的公共卫生问题之一。椎间盘突出症可导致疼痛、感觉障碍、肌力下降等症状,严重者甚至可导致截瘫,严重影响患者的生活质量。在椎间盘突出症的病理过程中,纤维环的破损是导致髓核疝出的直接原因,进而导致神经压迫、炎性因子释放等一系列级联反应。所以,如何妥善修复纤维环损伤是椎间盘突出症治疗中的关键问题。目前,临床应用的纤维环修复方法主要包括缝合、封堵等方法。然而这些方法的远期临床效果尚不确切。组织工程技术是修复重建组织缺损的良好方法,近年来有多项研究使用组织工程技术修复纤维环损伤。然而,由于对纤维环细胞与基质成分异质性的认知不足,目前纤维环的组织工程重建还存在诸多问题限制着该项技术的临床转化。首先,由于缺乏对纤维环细胞亚群构成的必要了解,目前对纤维环的重建方法难以准确重建纤维环的细胞成分。其次,由于纤维环的基质主要含有类纤维与类软骨两种成分,使用单一成分的材料难以同时适配两种不同的基质成分。此外,如何诱导种子细胞在修复环境中正确地分化,并参与到组织重建过程中,也是组织工程修复纤维环中的一个难题。所以,如何使纤维环修复材料能够适配纤维环细胞与基质的异质性,有待我们深入研究。目的本研究拟通过单细胞测序、细胞谱系示踪等技术,研究纤维环细胞的异质性,揭示纤维环细胞亚群的细胞图谱、阐释纤维环细胞分化过程,从而建立纤维环组织工程修复新策略。并在纤维环损伤动物模型中验证新策略的修复效果,及其临床转化前景。方法1.使用组织形态计量学方法以及组织免疫染色检测相关标志物的方法,对不同退变程度临床纤维环样本中的纤维环细胞进行形态与数量的分析比较,初步分析人纤维环细胞的异质性。2.使用单细胞测序技术揭示小鼠纤维环细胞亚群的具体情况,对各亚群的功能与特征进行分析。进一步通过对单细胞测序所筛选的标志基因进行免疫染色从而在组织水平鉴定单细胞测序所检测到的细胞亚群。3.使用细胞谱系示踪技术,以LepR-cre谱系细胞示踪纤维环干细胞的迁移分化路径。4.使用SFMA与HAMA制成复合水凝胶。并结合成纤维诱导剂与成软骨诱导剂的主要成分制成纤维软骨诱导剂。将复合水凝胶与诱导剂相结合,并对所形成的诱导型复合水凝胶进行材料的表征,及体外诱导分化作用的验证。5.将负载纤维环干细胞的诱导型复合水凝胶用于修复小鼠尾椎纤维环缺损,并从多角度评估修复效果。结果1.人纤维环细胞从组织形态学可主要分为长梭形细胞与类圆形细胞。严重退变的纤维环组织与中等退变相比,梭形细胞减少,类圆形细胞增多,且细胞的长径整体降低。此外,在严重退变的纤维环组织中Mmp13阳性的细胞亚群数量较中等退变者明显增多。2.单细胞测序揭示小鼠纤维环细胞可分为10个亚群,分别为纤维环干细胞,纤维样纤维环祖细胞,前纤维样纤维环细胞,未成熟纤维样纤维环细胞,成熟纤维样纤维环细胞,软骨样纤维环祖细胞,前软骨样纤维环细胞,未成熟软骨样纤维环,成熟软骨样纤维环细胞以及纤维软骨样纤维环细胞。其中,纤维环干细胞位于纤维环与椎体交界区的干细胞巢中,纤维样纤维环细胞位于外层纤维环,软骨样纤维环细胞位于纤维环内层。3.结合单细胞测序结果与谱系示踪技术,我们发现LepR-cre细胞谱系可用于纤维环干细胞的示踪。示踪结果显示,在小鼠出生后2周可检测到LepR-cre细胞从干细胞巢向纤维环内迁移,随着小鼠年龄增长纤维环中LepR-cre细胞逐渐增多。到小鼠10月龄时达到纤维环细胞的44.7%。对干细胞巢或纤维环与终板交界区进行损伤,均可阻断LepR-cre细胞向纤维环的迁移。4.结合单细胞测序结果与组织学验证,本研究发现一种纤维环细胞亚群,它同时表达纤维样标志物与软骨样标志物,位于纤维环的中间层。根据该亚群的功能,我们将其命名为纤维软骨样纤维环细胞。5.为适配纤维环的类纤维基质与类软骨基质,我们选用SFMA、HAMA并结合成纤维诱导剂与成软骨诱导主要成分配制的纤维软骨诱导剂（FCI）,制成SFMA/HAMA/FCI复合水凝胶。且发现该水凝胶具有良好的细胞相容性、力学稳定性及药物控释作用。并在体外验证了该水凝胶对纤维环干细胞的成纤维与成软骨双向诱导分化作用。6.使用负载纤维环干细胞的SFMA/HAMA/FCI复合水凝胶修复小鼠纤维环缺损,部分恢复了纤维环板层结构,显著降低了纤维环损伤组织学评分,显著提高了修复纤维环中的II型胶原面积。结论1.人纤维环细胞具有异质性,且在不同的椎间盘退变等级的纤维环中细胞亚群构成不同。2.小鼠纤维环可分为2个主要分化方向,成纤维方向与成软骨方向;其分化过程可分为5个阶段,分别为干细胞、祖细胞、前体细胞、未成熟与成熟细胞阶段。3.纤维环干细胞位于椎间盘干细胞巢中,并沿椎体与纤维环交界过度区向纤维环内迁移分化。4.本研究鉴定了一种纤维环新亚群,纤维软骨样纤维环细胞,可同时分泌纤维样与软骨样基质,位于纤维环中间层。5.本研究构建的SFMA/HAMA/FCI复合水凝胶可以诱导纤维环干细胞的成纤维与成软骨双向分化。并可在小鼠纤维环缺损的修复过程中,有效地恢复纤维环组织的类纤维基质与类软骨基质。综上所述,本研究通过单细胞测序技术,解码了小鼠纤维环细胞图谱,为纤维环修复提供了细胞学依据。基于此,我们提出了纤维环修复新策略,即使用适配纤维样与软骨样基质的复合水凝胶,结合成纤维与成软骨双向诱导的诱导因子,负载纤维环干细胞,从而对纤维环缺损进行修复重建。通过对小鼠纤维环缺损的修复实验,我们验证了该新策略可正确地初步重建纤维环的细胞与基质的异质性。为纤维环修复这一临床问题提供了新的解决思路。