Smad3对绵羊Myomaker基因5’调控区转录调控活性的影响

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Myomaker是肌肉发育过程中控制成肌细胞融合的肌肉特异性跨膜蛋白。目前,对绵羊Myomaker基因的研究鲜见报道。在前期研究中,本课题组扩增了绵羊Myomaker基因5’调控区并进行了生物信息学分析,发现该区域可能存在Smad蛋白反应元件SMAD3和GCSBE元件。本试验旨在进一步研究Smad3蛋白和SMAD元件对绵羊Myomaker基因5’调控区转录调控活性的影响,为Myomaker基因转录调控机制的阐明奠定基础。本试验在已克隆的绵羊Myomaker基因5’调控区的基础上,通过将SMAD元件突变为特定酶切位点,以EGFP为报告基因,构建了 SMAD元件突变型真核表达载体MyomakerProSMADM-EGFP,并分别转染至C2C12成肌细胞中,研究SMAD元件突变对绵羊Myomaker基因5’调控区转录调控活性的影响;并进一步深入系统地研究Smad3对绵羊Myomaker基因转录调控的影响,通过荧光定量PCR和EMSA实验进行了检测。结果表明:(1)SMAD3和GCSBE元件影响EGFP mRNA的表达,且SMAD元件对绵羊Myomaker基因5’调控区转录调控活性的影响与细胞的状态有关。组织水平EMSA实验结果表明,在绵羊胎羊肌肉组织细胞核蛋白中存在着可与SMAD3元件相结合的特异性转录因子—Smad3蛋白。(2)过表达或沉默Smad3基因对EGFP mRNA表达的影响与成肌细胞生长和分化时期有关。细胞水平的EMSA实验结果表明,过表达Smad3对绵羊Myomaker基因5’调控区转录调控的影响是通过SMAD3元件介导的。综上所述,Smad3对绵羊Myomaker基因启动子转录调控活性的影响与细胞分化状态有关,其作用机制至少部分是通过Smad3蛋白与SMAD3元件结合而介导的。
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