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研究背景肾上腺脊髓神经病变(Adrenomyeloneuropathy,AMN)是X连锁肾上腺脑白质病变(X-adrenoleukodystrophy,X-ALD)的迟发型表现。X-ALD是最常见的过氧化物酶病,它是一种由ABCD1基因突变引起的疾病。ABCD1基因编码一个过氧化物酶膜蛋白即肾上腺脑白质营养不良蛋白(Adrenomyeloneuropathy Protein,ALDP),其长度为745个氨基酸残基。ABCD1基因突变后会使ALDP蛋白功能缺陷从而使β氧化在过氧化物酶体内不能正常进行,而β氧化的减少终将导致极长链脂肪酸(VLCFA:≥C22)在各个组织内的异常蓄积。X-ALD的临床类型包括单纯Addison病型,脑ALD(儿童型,青少年型和成人型),伴或不伴颅内脱髓鞘的AMN以及无症状或症状前期型。该疾病主要影响肾上腺皮质和神经系统。神经系统的病理改变具有多样性,可以是炎性脱髓鞘,也可以表现为累及脊髓上行和下行纤维束的轴索病变。ABCD1基因定位于Xq28,由10个外显子组成,编码长4.3kb的mRNA。目前已知的ABCD1基因突变超过775个,包括大片段删除、移码突变、过早终止和错义突变。X-ALD的基因型和表型之间无明确相关性。因此,对每个新的ALD家族进行ABCD1突变分析都是非常必要的。自噬是在真核细胞中负责蛋白质降解的生理过程。有研究显示ABCD1基因敲除鼠脊髓中可以观察到自噬流受损,而人成纤维细胞中过量的VLCFA也会降低自噬的水平。本研究中我们临床筛查了一个AMN家系,对家系成员进行了临床和神经影像学检查、高通量基因测序明确ABCD1基因新突变,并对突变体ALDP蛋白的稳定性及致病机制进行研究。第一部分AMN患者ABCD1基因突变位点的新发现及蛋白功能预测目的统计并分析患者临床资料,进行ABCDI基因测序以了解该家系的基因突变情况,同时对突变基因进行蛋白质功能预测方法以就诊于郑州大学第一附属医院的AMN家系为研究对象,收集临床症状、影像学改变、电生理结果、血浆VLFCA水平等临床资料。提取患者及亲属DNA进行ABCD1基因突变筛查,应用Phyre2软件预测野生型ALDP的功能区域、跨膜螺旋区域和三级结构,以及预测新的突变体ALDP的三级结构,并对二者进行对比。应用 PolyPhen2,Align GVGD、PROVEAN、Mutation Taster 和 SIFT 软件预测发生的突变基因是否为致病性突变。结果1.临床结果患者的临床症状、影像学改变、电生理结果、VLFCA水平均符合典型的AMN诊断标准。2.测序结果通过高通量基因测序发现先证者ABCD1基因存在1个尚未被报道的错义突变(c.332T>G),患者的母亲和2个女儿均存在c.332T>G杂合突变改变,均为携带者,该突变导致氨基酸序列的改变,即p.V111G。3.生物信息学评估同源性分析结果提示位于ALDP密码子111位置的颉氨酸是高度保守的。构建了 ALDP三级结构的计算机模型,突变型和野生型ALDP三级结构有差异。PolyPhen,Align GVGD、Mutation Taster、PROVEAN 和 SIFT 软件测评结果提示V111G突变ALDP具有明确结构异变及致病性。结论1.发现一个新的ABCD1错义点突变,即c.332T>Gp.V111G,拓展了 X-ALD的基因突变数据。2.生物信息学软件预测V111G突变所表达的突变蛋白存在结构异变和致病性。第二部分ABCD1突变基因的蛋白表达及与自噬关系的研究目的了解突变ABCD1基因的蛋白表达,并验证ALDP(V111G)的致病机制。方法利用分子克隆技术,构建野生型及突变型ALDP的真核重组载体:pEGFP-N1-ABCD1和pEGFP-N1-ABCD1-V111G。将重组质粒转染人胚胎肾细胞HEK-293T,并应用共聚焦荧光显微镜和免疫印迹检测GFP-ALDP融合蛋白的表达。应用免疫印迹技术检测LC3Ⅱ和Beclin-1的表达,以了解细胞内自噬水平。结果1.质粒构建通过酶切和测序证实,我们成功构建了野生型及突变型ALDP质粒。2.免疫荧光检测GFP-ALDP(V111G)突变体表达较野生型GFP-ALDP表达下调,细胞免疫荧光显示GFP-ALDP的绿色荧光呈团块状分布,而GFP-ALDP(V111G)的绿色荧光呈散在的点状分布。用荧光显微镜看细胞骨架和细胞核的共染情况。发现野生型GFP-ALDP呈团块状,并正常定位于HEK-293T细胞质的过氧化物酶体中。然而,突变型GFP-ALDP(V111G)散在分布于细胞质中。3.免疫印迹检测与野生组相比,GFP-ALDP(V111G)突变型重组质粒转染细胞组所表达GFP-ALDP 水平显著降低(P<0.01)。GFP-ALDP(V111G)表达诱导 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(P<0.01)以及 Beclin-1(P<0.05)的表达下调。结论1.GFP-ALDP(V11 1G)表达较GFP-ALDP下调,其可能减少ALDP与过氧化物酶体的结合。2.GFP-ALDP(V111G)表达诱导 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 及 Beclin-1 的表达下调,抑制细胞巨自噬水平。