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第一部分 超声破裂载基因微泡介导基因转染 目的: 现已有多种方法应用于非病毒载体转染培养心肌细胞,但其转染效率仍不理想。采用超声照射增强质粒转染效率已有报道,但其需要高能治疗性超声照射,细胞损伤严重。近年来研究发现传统的超声对比剂-含气微泡能明显增强超声介导的基因转染与表达,同时体内实验发现通过超声靶向破裂载基因微泡能定向传输基因,表明其是一种良好的基因传输方法。然而体外转染实验研究结果多来至于肿瘤细胞及永生细胞系基因转染,关于原代细胞外源基因转染研究较少,且采用超声破裂微泡进行原代培养心肌细胞这一终末分化细胞的质粒DNA转染尚未见报道。本研究采用诊断性低能超声破裂微泡介导报告基因及反义RNA真核表达质粒转染原代培养心肌细胞,观察其能否增强外源基因在心肌细胞内的转染与表达,同时探讨超声对比剂性质、浓度及超声照射参数对基因转染效率的影响。为寻求一种新的高效基因转染方法及临床应用提供理论依据和经验。沁声,砍犷博士学位论文材料与方法:1、pLB反义RNA表达质粒的构建 PLB反义RNA真核表达质粒由PAAv·asPLB亚克隆而得。PAAV‘asPLB及PcDNA4质粒质粒经Ec口Rl及肠口I双酶切后进行连接、转化,扩增阳性克隆,将鉴定正确的反义PLB重组子进行基因测序以进一步鉴定。D一galactosidase质粒为SV4O启动子调控的表达p半乳糖昔酶的报告基因质粒。2、载基因微泡的制备 采用自行改良的超声声振法制备声振白蛋白微泡(air sonicated dextrosealbumin mierobubbles,ASnA)或氟碳气体白蛋白微泡(perfluorobutane一exposedsonieated extrose albumin mierobubbles,PESDA)。小心吸取微泡溶液,加入质粒,轻晃混匀,4℃静置1小时使质粒粘附于微泡表面后备用。3、心功能测定 静脉注入载基因微泡,二维超声监测微泡进入心腔及心肌毛细血管情况。经兔右颈总动脉置入动脉导管至左心室,持续监测心功能变化。4、心肌细胞培养 取乳鼠心肌细胞进行原代培养,待细胞达到70%汇合时进行基因转染。5、基因转染方案 报告基因p一galactosidase转染设组如下:①空白对照组;②单纯质粒转染组;③超声照射转染组;④超声破裂载基因ASDA微泡转染组;⑤超声破裂载基因PESDA微泡转染组:⑥磷酸钙共沉淀转染;⑦磷酸钙共沉淀联合超声破裂 微泡转染组:此组分为3个亚组,分别于磷酸钙共沉淀转染的同时、6小时前及 6小时后进行超声破裂微泡处理。反义RNA转染设组如下:①空白对照组;② PcDNA4空质粒转染组:③PcDNA4一asPLB质粒转染组。PcDNA4空质粒转染组 及PcDNA4一asPLB质粒转染组分别采用裸质粒转染、超声照射转染、磷酸钙共 沉淀转染及超声破裂载基因微泡转染。其基因转染方法同报告基因转染组,仅 采用报告基因转染组优化参数。 6、p一半乳糖普酶原位染色加;’,砍才博士学位论文 基因转染48小时后固定细胞,加0.5m1X一GAL染色液,37℃温浴12小时后光学显微镜下观察细胞染色情况。7、p一ga 1 actos 1 dase酶定量$IJ定 参照试剂盒说明书进行p一galactosidase酶定量检测,酶活性均经蛋白含量校正,蛋白含量采用Bradford法测定。8、细胞活性测定 采用MTT法进行细胞活性测定,细胞活性计为A‘脸。/A。护100%。9、PLB及SERCAZa mRNA表达水平测定 采用半定量逆转录多聚酶链式反应(RT一PCR)测定mRNA。PLB、SERCAZa及p·actin共同扩增的产物电泳后,分别测定每一个目的基因及参照基因p一actin的吸光度(A)值。10、免疫印迹法检测PLB及SERCAZa蛋白水平 细胞转染后48小时提取蛋白,1 spg蛋白经10%(PLB)或5%(SERCAZa)SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳、转膜后,分别与一抗、二抗作用。ECL法显色,曝光。11、统计学处理 实验结果以又士:表示,采用SPSSIO.0统计软件进行单因素方差分析或非配对t检验处理,P<0.05为差异有显著性。结果:1、质粒构建 构建出含反向连接PLB全长(695bP) cDNA的PcDNA4一asPLB的真核表达质粒。测序结果与GeneBank大鼠PLB基因联机BLAST同源比较,证实同源性100%。2、载基因微泡的制备 ASDA与PESDA直径、浓度无显著性差异(P>0.05)。勃附质粒后两种微泡直径与豁附前无显著性差异(P>0.05)。3、经静脉注入载基因微泡及靶向超声破裂载基因微泡对心功能的影响 血流动力学检测显示经静脉注射载基因微泡及超声靶向破裂载基因微泡加;’,J.犷博士学位论文时,左室收缩期峰压、最大舒张末压、+dP/dt Max及一dP/dt Max均无明显变化。4、p一Ga!actos 1 dase表达水平的检测 原位染色发现,超声破裂ASDA/PESDA微泡转染组细胞染色较其它组明显增强,其中以磷酸钙转染同时进行超声破裂微泡组为最强。 定量检测发现,在优化条件下,超声破裂载基因PESDA转染组基因表达水平显著升高,几乎为单纯质粒转染组表达水平的60倍,差异具有显著性意义 (P<0.01)。基因表达水平随超声发射强度增强而增高。在一定浓度范围内,基因表达水平随微泡浓度升高而增高,在不同浓度组,PESDA组基因表达水平明显均高于ASDA组(P<0.05)。磷酸钙共沉淀同时及6小时后联合超声破裂微泡转染组基因表达较磷酸钙共沉淀转染组明显增