论文部分内容阅读
琥珀酸是工业上一种重要的C4平台化合物，它作为有机合成原材料、中间产物或化学品，广泛应用于制药、食品添加剂、绿色溶剂及可降解塑料等多种领域。微生物发酵法生产琥珀酸因具有对环境友好和摆脱对石化原料依赖的特性，已成为国际上的研究热点。本文采用基因组改组技术选育耐酸性琥珀酸产生菌株。以琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC1593为出发菌株，分别经过紫外线-甲基磺酸乙酯(UV-EMS)和紫外线-硫酸二乙酯(UV-DES)诱变处理，得到7株耐酸性有所提高的突变株，以此为基因组改组的出发菌库，经三轮原生质体递进融合，筛选获得4株能够在pH5.6条件下生长良好且产酸提高的改组菌株，并对其中一株F3-21的发酵性能进行了研究。主要研究内容如下：
⑴通过菌种生长特性的试验，确定筛选平板和液体筛选培养基的临界pH为5.6；确定采用菌龄12 h的菌体进行诱变处理和原生质体的制备。通过致死曲线的测定，确定UV-EMS诱变的条件为UV照射20 s，2.0% EMS处理30 min； UV-DES诱变的条件为UV照射20 s，0.8% DES处理20 min。A.succinogenes CGMCC1593分别经上述两种方法诱变，经低pH筛选平板和液体筛选培养基初筛，厌氧瓶发酵复筛后，获得7株耐酸性较好的高产突变株UE-7、UE-10、UE-12、UE-16、UD-6、UD-11、UD-15。
⑵通过对菌体原生质体制备、再生及融合的影响因素试验，确定:细胞壁酶解前添加0.4%的甘氨酸促进酶解，原生质体制备条件为溶菌酶浓度0.1 mg/mL，37℃酶解30min；缓冲液为PB磷酸高渗液；原生质体再生培养方式采用双层平板再生；原生质体经37℃融合5 nun时的融合率达2.78×10-5。
⑶通过三轮多母本原生质体递进式融合，筛选得到4株耐酸性较好的高产改组菌F3-5、F3-9、F3-14和F3-21，其中F3-21摇瓶发酵48 h琥珀酸产量为34 g/L，较原始亲株提高48%。并且，F3-21的耐酸性相对原始亲株有明显提高。在pH5.8的完全液体培养基中，F3-21的菌体浓度为原始亲株的2.5倍；pH5.6时为原始亲株的7倍，且在pH5.2时F3-21仍能生长。
⑷在5L发酵罐中进行分批发酵，用MgCO3控制低pH(pH5.6-6.0)厌氧发酵48 h，F3-21积累琥珀酸38.1 g/L，较原始亲株(26.2 g/L)提高45%，MgCO3总的用量比原始菌减少了22.5%。控制正常pH( pH6.5-7.0)厌氧发酵32 h，F3-21产琥珀酸40.7 g/L，糖利用率81.4%。采用补料分批发酵策略时，F3-21发酵72 h琥珀酸最高产量达67.4 g/L。当用相对廉价的Na2CO3控制发酵pH6.5分批发酵时，F3-21厌氧发酵32 h琥珀酸积累41.5 g/L，最终糖利用率达83%，略优于MgCO3控制pH6.5-7.0策略的发酵水平(琥珀酸40.7 g/L，糖利用率81.4%)。表明Na2CO3可以代替MgCO3调节菌株F3-21发酵过程的pH，从而可以达到降低琥珀酸发酵生产成本的目的。