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D-甘露醇(D-Mannitol)作为一种功能性糖醇,广泛应用于医药工业、食品工业及化学工业等领域。近年来,利用重组微生物合成D-甘露醇的方法因其更加安全、环境友好及较高的特异性越来越受到重视。大肠杆菌(Escherichia coli)拥有最成熟的基因操作方法,并已被普遍接受作为生产生物基化学品的优秀平台,因此可以作为生物合成D-甘露醇的优良宿主。本研究从野生型大肠杆菌ATCC8739出发,将来自假肠膜明串珠菌Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC12291菌株的D-甘露醇脱氢酶基因与果糖转运蛋白基因整合到大肠杆菌ATCC8739的染色体中,并失活其他的发酵途径,构建了一株遗传稳定的D-甘露醇生产菌株Mtl-002, D-甘露醇的产量达到1.15mmol/L。在该菌株中失活大肠杆菌的磷酸酶转移系统,并使用半乳糖透性酶(Galactose permease, GalP)和果糖转运蛋白(fructose transporter, FupL)进行葡萄糖和果糖的转运,获得的菌株Mtl-003使用无机盐培养基,以葡萄糖果糖作为混合碳源厌氧发酵6天,D-甘露醇的产量达到1.21mmol/L。基于菌株Mtl-003中细胞生长和D-甘露醇合成的偶联,进一步通过代谢进化技术提高细胞合成D-甘露醇的生产能力。经过80代的驯化后得到的菌株Mtl-004,D-甘露醇产量达到4.4mmol/L,D-甘露醇脱氢酶的酶活为0.38U/mg pro,MDH的编码基因内部发生了突变D301Y(g901t)。为了进一步提高细胞对果糖的转运能力,将调控后的葡萄糖转运蛋白(Glucose facilitator, glf)基因整合到Mtl-004中获得菌株Mtl-005,其发酵产D-甘露醇的量达到6.22mmol/L。之后,为了以葡萄糖为底物直接生产D-甘露醇,将来自米苏里游动放线菌Actinoplanes missouriensis(DSM43046)中的葡萄糖异构酶(glucose isomerase, aGI)基因整合到菌株Mtl-005中。使用不同强度的调控元件对aGI的表达强度进行调控,其中的一株菌Mtl-009,以葡萄糖为唯一碳源发酵产D-甘露醇的量最高达到6.44mmol/L。通过将D-甘露醇合成途径中的D-甘露醇脱氢酶基因,果糖转运蛋白的编码基因和葡萄糖异构酶基因整合在大肠杆菌的染色体中,本研究成功构建了一株能够稳定遗传的以葡萄糖为碳源生产D-甘露醇的菌株,D-甘露醇的最高产量为6.44mmol/L。