β-内酰胺类抗生素在治疗人和动物的细菌感染中是使用最广泛的种抗生素，也是治疗奶牛乳腺炎的常用药物，还被用于动物饲料以促生长和集体预防性治疗。因此，牛奶中的抗生素残留最常见种类为β-内酰胺类抗生素。为了控制该类抗生素的滥用，延缓细菌抗药性的形成，保护消费者的健康，对于可食动物组织和牛奶中的β-内酰胺类抗生素的残留检测是非常重要的。除此之外，牛奶中的β-内酰胺类抗生素残留还会严重影响后续加工中奶制品品质，比如奶酪、黄油和酸奶的起酵以及后期风味的形成。因此，各国政府都制定了食品和牛奶中的最大残留限量来控制消费者摄入抗生素的水平，我国235号农业部公告明确规定了牛奶中8种-内酰胺类抗生素的最高残留限量，在4-100ppb；欧盟理事会第2377/90号规定牛奶中16种-内酰胺类抗生素的最大残留限量，在4ppb-125ppb。可见为满足企业和市场的需求，建立种简单快速灵敏又廉价的残留检测方法是非常迫切的。目前市场上检测牛奶中的β-内酰胺类抗生素残留的快速检测方法主要包括微生物生长抑制法、免疫分析法和受体分析法三类。微生物法需要较长的培养时间，人为因素影响大且存在很难实现标准化定量检测等缺点。免疫分析法(ELISA)具有简单快速、特异性强，灵敏度高，处理量大等优点成为了发展最快、应用最广的抗生素残留快速测定方法。受体与抗体相比的优势在于，受体蛋白更容易大量制备，受体检测法用种试剂盒，种酶标竞争物，可以检测多种β-内酰胺类抗生素残留，而且受体能够检测有活性的结构完整的β-内酰胺类抗生素。本实验试图利用来自肺炎链球菌R6菌株中的新型受体——PBP3为检测试剂，建立受体-酶-β-内酰胺类抗生素残留检测方法，为构建简便、处理量大、灵敏度高、可定量又廉价的快速检测试剂盒提供研究基础。本实验克隆了肺炎链球菌R6的pbp3基因,成功构建了原核表达载体pGEX-6p-pbp3*并转化大肠杆菌表达,纯化出可溶性PBP3蛋白,而且有活性，为PBP3的结构及应用研究奠定了基础。N端截短的PBP3*共399aa,通过氨基酸测序得到验证，大约43.6kD,加上该质粒表达的29kD的GST标签蛋白和蛋白酶序列，GST-PBP3*融合蛋白大约73kD。培养1L工程菌可得到菌湿重6.6g，纯化后获得PBP3*蛋白23mg/L,得率0.35%。 SDS-PAGE测得纯化后PBP3*蛋白的纯度可达95%。利用PBP3对头孢喹诺的结合试验来验证了纯化后的PBP3*蛋白有活性，对头孢喹诺的亲和性较高，IC50值达到6.2μg/kg。同时测定了PBP3*蛋白的等电点在pH4.5，用来有效的规避实验操作中PBP3*蛋白的沉淀。然后利用纯化出的有活性的受体蛋白建立受体-酶--内酰胺类抗生素残留检测方法。利用PBP3*受体蛋白能够与-内酰胺类抗生素配体特异性结合的原理，参考ELISA的方法，将纯化的受体蛋白PBP3*代替抗体，固定在96孔聚乙烯板上，以HRP-Amp酶标物与游离的多种-内酰胺类抗生素竞争性与受体结合，通过HRP标记物的酶促显色反应，建立了-内酰胺类抗生素竞争结合受体的标准曲线；测得了多种-内酰胺类抗生素与PBP3*结合的IC50值以及检测限和定量限，不同的IC50值体现了PBP3*受体蛋白的结合力对不同-内酰胺类抗生素有定差异，对于亲和力较高的如阿莫西林、头孢吡啉、头孢喹诺等可以达到检测要求；测得的交叉反应率显示了PBP3*对-内酰胺类抗生素的结合特异性；验证了PBP3*对头孢喹诺的结合力比PBP2x高，可以更有效的用于试剂盒构建；精密度实验暴露了该方法存在的问题，批内批间差异较大，重复性不好，有待进步优化反应条件；与Randox的ELISA试剂盒对比显示，对于PBP3*亲和力较高的青霉素类，受体检测法和ELISA方法灵敏度相差无几；牛奶样品添加回收实验中，低浓度回收率较低，有待优化。本实验完成了受体-酶联检测试剂盒的初步构建，原核表达体系的成功构建保证了受体蛋白用于试剂盒的廉价优势，但是重复性不好，精密度不够，还需要进步对试剂盒进行调制。考虑到受体检测法的优势是明确的，比抗体容易大量制备，对青霉素类抗生素和头孢噻呋类抗生素都有结合，PBP3*蛋白的亲和力比市场上试剂盒普遍采用的PBP2x的亲和力高，为试剂盒的构建提供了保证，进步的研究是有前景的。若要构建可以推向市场的试剂盒，需要进步优化该方法，提高精密度和回收率以及保证长时间的有效期等。