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前言卵巢癌是妇科死亡率最高的恶性肿瘤,它的发生机制一直是妇科肿瘤基础与临床研究探索的重点。卵巢癌的发生与发展是一个极其复杂的多因素的过程,目前对其发生机理尚不清楚。细胞膜的脂双层外,几乎全部被一些糖蛋白或糖脂上的糖链所覆盖,形成一层糖衣。糖蛋白通过不同方式镶嵌在或连接于细胞膜上,外露的糖链部分对细胞一细胞、细胞-分子的识别十分重要,参与配体结合、信号转导、分子粘附等分子间的相互作用,与细胞生长、凋亡、分化等重要生命过程密切相关,被称为细胞间的信使。目前对于糖链的研究已不单满足于整条糖链的功能,已深入到各个糖基的功能,这方面已有一些报道,却远未阐明,已成为糖生物学和细胞生物学的共同热点。Lewis y抗原是存在于细胞表面糖脂和糖蛋白糖链上的双岩藻糖寡糖,1,2-岩藻糖转移酶(1,2-fucosyltransferase,1,2-FT)是Lewis y抗原合成的终末关键酶。我们将1,2-FT基因转入人卵巢癌细胞株RMG-I内,建立了Lewis y高表达细胞株RMG-I-H,发现基因转染后的卵巢癌细胞恶性生物学行为加强,对化疗药5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、卡铂等耐药性也增加。我们在前期研究中发现Lewis y高表达细胞株RMG-I-H中血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)表达增高。为了进一步阐明Lewis y抗原在卵巢癌发生、发展中的作用机制,我们在前期工作的基础上,通过比较转染1,2-FT前后RMG-I细胞表面VEGF受体的变化,进一步探讨Lewis y在卵巢癌恶性进展中的作用,为卵巢癌发生、发展机制的研究提供新的途径。材科和方法一、细胞株及裸鼠移植瘤模型建立细胞株RMG-I细胞源于人卵巢透明细胞癌组织,细胞株RMG-I-H为1,2-FT及Lewis y抗原高表达细胞系。选取10只4-6周龄健康雌性裸鼠,体重(20.4±0.6)g,随机分成两组,实验组与对照组裸鼠背部皮下分别注射RMG-I-H及RMG-I细胞悬液0.3m1,在SPF条件下饲养裸鼠,五周后处死,取出皮下瘤块,制备成石蜡块。上述裸鼠皮下移植瘤经病理检查证实为低分化卵巢透明细胞癌。二、免疫细胞化学方法两组细胞铺片,4%多聚甲醛固定,染色方法按SP试剂盒说明书进行。一抗兔抗人血管内皮生长因子受体1(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1,VEGFR1/Fms-like tyrosine kinase,Flt-1)和兔抗人血管内皮生长因子受体2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2,VEGFR2/Kinase insertDomain-containing,KDR)多克隆抗体分别1:200和1:100稀释。以细胞浆、细胞膜有棕黄色颗粒着色为阳性判定标准。拍照并以图像分析软件Meta Morph计算各组累积光密度值。三、免疫组织化学方法卵巢癌RMG-I和RMG-I-H裸鼠皮下移植瘤石蜡块标本,连续切片,厚度为4μm,进行微波抗原修复。其余均同上。四、RT-PCR取指数生长期的卵巢癌RMG-I和RMG-I-H细胞行总RNA的提取(Trizol法),RT-PCR参照TAKARA试剂盒说明书操作。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,EB染色后拍照。试验中分别设立各样本的β-actin作为对照。拍照并以图像分析软件Quantiscan分析处理,以各自内参照β-actin表达量为基准计算各样本的相对含量。五、统计学分析方法所有数据均以SPSS13.0软件进行分析,采用t检验比较Flt-1、KDR在卵巢癌细胞系RMG-I-H和RMG-I中表达的差异。所有数据均以(x±s)表示,P＜0.05似为差异有统计学意义。实验结果一、Flt-1、KDR蛋白在卵巢癌细胞系RMG-I-H和RMG-I中的表达免疫细胞化学染色观察发现,Flt-1及KDR均弥散分布于胞浆和胞膜。Flt-1在RMG-I-H细胞中染色阳性颗粒呈棕黄色或淡黄色,其积分光密度为21.000±1.255,而在RMG-I中染色阳性颗粒呈淡黄色,积分光密度值为17.868±1.818,两种细胞中染色强度无明显差异(P=0.411)。KDR在RMG-I-H中染色阳性颗粒呈棕黄色或淡黄色,其积分光密度为24.245±2.168,而在RMG-I中染色强度减弱,阳性颗粒呈淡黄色,其积分光密度值为14.469±1.0443,KDR在RMG-I-H中染色强度明显高于RMG-I(P=0.002)。二、Flt-1、KDR蛋白在RMG-I-H和RMG-I裸鼠皮下移植瘤组织中的表达免疫组织化学染色结果发现,Flt-1及KDR在裸鼠皮下移植瘤组织中的表达情况与细胞中相似,两者均弥散分布于胞浆和胞膜。Flt-1在RMG-I-H移植瘤组织中染色阳性颗粒呈棕黄色或淡黄色,其积分光密度值为45.540±2.373,在RMG-I移植瘤组织中染色阳性颗粒呈淡黄色,其积分光密度值为42.009±2.905,两种裸鼠皮下移植瘤组织染色强度无差异(P=0.270)。KDR在RMG-I-H移植瘤组织中染色阳性颗粒呈棕黄色或淡黄色,其积分光密度值为71.519±2.558,而在RMG-I移植瘤组织中染色阳性颗粒呈淡黄色,其积分光密度值为45.977±1.879,KDR在RMG-I-H移植瘤组织中染色强度明显高于RMG-I(P=0.001)。三、Flt-1、KDR mRNA在卵巢癌细胞系RMG-I-H和RMG-I中的表达在细胞系RMG-I-H和RMG-I中,Flt-1 mRNA的相对表达含量分别为0.896±0.042和0.788±0.100,两者间无差异(P=0.120);而KDR mRNA的相对表达含量分别为0.680±0.030和0.463±0.018,RMG-I-H中KDR mRNA的相对表达含量明显高于RMG-I(P=0.003)。与蛋白的表达一致,转染后细胞中KDR在基因水平的表达增高,而Flt-1的表达没有显著变化。结论Lewis y抗原增加引起卵巢癌细胞系RMG-I KDR受体表达增高,其变化在基因水平调节。Lewis y抗原可能通过VEGF自分泌和旁分泌途径介导卵巢癌的增殖、侵袭、转移和耐药等生物学行为。