论文部分内容阅读
目的贲门失弛缓症(AC)患者食管壁可观察到肌层增厚及胶原蛋白沉积等重塑现象,但其在AC发病过程中的作用未知。本研究首先在AC患者及模型动物食管肌层评估嗜酸性粒细胞(EOS)的浸润程度和重塑因子的表达水平,并探讨两者相关关系,然后通过体外实验研究EOS对食管平滑肌细胞重塑的诱导作用及机制,最后探讨抗EOS药物在食管组织重塑及AC治疗方面的作用,以期从平滑肌重塑角度深入认识本病发病机制并找到新的治疗靶点。方法(1)组织病理学研究:连续纳入就诊于我院,经食管测压、食管排空及胃镜等检查确诊为AC,并接受POEM治疗的40例患者为实验组,选取同期行外科食管切除术的10例食管癌患者为对照组。两组分别于术中获取LES固有肌层标本(对照组选择病变边缘>5cm的正常组织)。所有标本均行HE染色,评估食管肌层EOS浸润情况;行Masson染色,评估食管肌层纤维化程度;行免疫荧光染色,观察食管平滑肌细胞束的骨架形态;利用透射电镜初步观察食管平滑肌细胞的微观结构;通过免疫组化及Western Blot实验,从定性和定量的角度分析重塑因子:转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ的表达水平;在POEM术前和术后3个月、6个月、1年和2年分别利用Eckardt评分及多项临床检查,评估患者症状和食管动力,并分析AC患者食管肌层EOS计数和重塑因子的表达水平与临床参数的相关关系。食管平滑肌厚度研究:纳入确诊为AC,并接受POEM治疗的10例患者为实验组,选取同期因胃窦隆起行超声内镜检查的10例患者为对照组。两组患者均接受食管排空和超声内镜检查,分别测量实验组术前、术后2年及对照组患者检查过程中食管最大宽度、检查1,3,5分钟钡剂高度以及食管LES、LES以上5cm、10cm和15cm处固有肌层厚度,分别比较实验组患者治疗前后,以及实验组与对照组患者上述指标的差异。(2)取8周龄Balb/c小鼠80只,分为模型组(机械梗阻组、单纯EOS浸润组、机械梗阻联合EOS浸润组)和对照组。造模成功后,通过动力学检查(食管测压和食管排空)和病理学检测(HE染色观察小鼠食管肌层EOS浸润情况;Masson染色评估小鼠食管肌层纤维化程度),进一步行免疫组化染色和WesternBlot评估各模型组和对照组小鼠食管平滑肌组织中TGF-β1、α-SMA、胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ的表达水平;以最符合EOS浸润AC患者临床及病理改变的机械梗阻联合EOS浸润的模型组进行进一步研究,分离机械梗阻联合EOS浸润组和对照组小鼠离体食管肌条,置入装有Kreb’s液的恒温肌槽中,利用生物机能实验系统记录电刺激下离体肌条的收缩幅度及变化情况,并进行两组间比较。(3)取2月龄SD大鼠5只,分离食管平滑肌细胞及EOS进行体外培养,设置以下分组:细胞对照组(平滑肌专用培养基+食管平滑肌细胞);EOS联合处理组A:平滑肌专用培养基+食管平滑肌细胞+非活化的EOS共培养;EOS联合处理组B:平滑肌专用培养基+食管平滑肌细胞+活化的EOS共培养;EOS联合处理组C:平滑肌专用培养基+食管平滑肌细胞+TGF-β1抑制剂+活化的EOS共培养。MTT法观察共培养不同时间节点平滑肌细胞增殖情况,通过Western blot实验检测共培养48h后各组TGF-β1、α-SMA,胶原蛋白Ⅰ,胶原蛋白Ⅲ以及TGF-β/Smad依赖性信号转导通路的信号分子Smad2/3蛋白和磷酸化Smad2/3蛋白的含量。(4)取Blab/c小鼠30只,随机分为3组,AC模型组,抗Siglec-F抗体干预组和对照组。干预后通过食管测压和食管排空检查比较各组小鼠食管运动功能差异;通过HE染色、Masson染色和免疫学染色比较各组小鼠食管EOS浸润程度、食管肌层纤维化程度以及食管组织中TGF-β1、α-SMA、胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ的表达情况。结果(1)组织病理学研究:实验组中,17/40(42.5%)例患者LES肌层EOS计数及分布均较对照组明显增多(P<0.05);32/40(80%)例患者LES肌层可见不同程度的纤维化条索穿插于肌细胞间,较对照组严重(P<0.05);实验组患者的组织标本可见平滑肌细胞束形态较对照组明显增厚且排列紊乱;透射电镜下观察到实验组患者组织标本中胶原纤维细胞成束状分布且明显增多,胞质中观察到肌成纤维细胞;实验组患者LES肌层重塑因子(TGF-β1、α-SMA、胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ)的表达均较对照组有不同程度的增加(P值均<0.05),且浸润的活性EOS与TGF-β1存在共表达;随访POEM治疗2年后,发现所有入组的AC患者食管蠕动功能均未恢复;并且,EOS浸润程度和重塑因子的表达水平与术后Eckard评分呈正相关关系。食管平滑肌厚度研究:实验组患者术前食管最大宽度和1,3,5分钟钡剂高度均显著高于对照组(P值均<0.05),术后食管最大宽度与术前相比无明显差异(P>0.05),1,3,5分钟钡剂高度明显降低,与对照组相比无差异(P值均>0.05);POEM术前LES、LES以上5cm,LES以上10cm和LES以上15cm的环形肌层均较对照组显著增厚(P值均<0.05),且以LES处增厚程度最大,而各部位纵形肌厚度与对照组相比差异无显著性;POEM治疗后2年复查,可见实验组患者环形肌层仍呈增厚状态,与术前相比,无明显改变(P值均>0.05)。(2)造模后,各模型组小鼠体重增长均少于对照组(P值均<0.05),LES压力均显著高于对照组(P值均<0.05),食管体部和贲门部排空时间均较对照组延长(P值均<0.05)。组间比较发现:单纯EOS浸润组和机械梗阻联合EOS浸润组LES肌层均有EOS浸润,明显多于对照组及机械梗阻模型组(P值均<0.05),且机械梗阻联合EOS浸润组能观察到更明显且较粗的纤维化条索穿插于肌细胞之间并伴有平滑肌细胞萎缩,此外,机械梗阻联合EOS浸润组中重塑因子的表达水平高于其他各模型组(P值均<0.05),以上均提示机械梗阻联合EOS浸润组动物更为符合EOS浸润的AC患者临床及组织特征,EOS浸润AC动物模型建立成功。进一步发现,EOS浸润AC小鼠模型食管平滑肌组织中TGF-β1、α-SMA、胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ的表达水平均明显高于对照组(P值均<0.05);在一定参数的电刺激下,模型组小鼠食管离体肌条收缩幅度明显低于对照组小鼠(P<0.05)。(3)联合处理组B(有活性EOS且无TGF-β1抑制剂)的食管平滑肌细胞存活率在不同时间节点均较其他组更高(P值均<0.05);共培养48h后检测发现EOS联合处理组B的各项重塑因子蛋白表达量显著高于其余各组(P值均<0.05);同时共培养48h后,EOS联合处理组B中TGF-β/Smad依赖性信号转导通路的信号分子磷酸化Smad2/3蛋白表达量显著高于其余各组(P值均<0.05)。(4)抗Sigec-F抗体组小鼠食管动力学检测结果较模型组小鼠好转,病理学指标虽尚未完全改善,但是EOS浸润情况和部分重塑因子的表达水平较模型组明显降低(P值均<0.05),且与对照组无显著性差异(P>0.05)。结论AC患者存在EOS浸润食管肌层和食管平滑肌重塑现象,并与预后相关;通过机械梗阻联合EOS浸润动物模型可以模拟EOS浸润的AC患者临床和病理学特征;EOS可能通过TGF-β/Smad依赖性信号转导通路引起食管组织重塑,并进一步导致食管运动障碍,促进AC发生;抗EOS药物可能有助于治疗伴随EOS浸润和组织重塑的AC。