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番茄(Solanum lycopersicum)是世界范围内普遍种植的重要蔬菜作物之一,同时也是进行植物生物学研究的模式植物之一。目前已被广泛地应用于番茄植株有关性状方面的科学研究中,番茄叶色和株高会对番茄植株的生长发育具有重要影响,而叶色的变化与叶绿体的结构、叶绿体内光合色素的含量等密切相关,内源赤霉素含量的多少影响植株的高矮。虽然许多基因已经被鉴定参与叶绿体的形成,但是叶绿体形成的调控机理仍然不清楚。 在本研究中,我们克隆并鉴定了Solyc03g033560基因,该基因编码一个包含RanBP结构域的锌指蛋白。锌指蛋白基因参与植物多个生长发育过程的调控,包括果实发育、逆境响应、激素调节等过程。Ran BP2类锌指蛋白转录因子在人类和动物中已经有研究,但是在植物中,该类转录因子的生物学功能未见报道。因此,需要进一步研究Ran BP2 ZFPs在植物中的作用,更好地阐明这些转录因子在植物发育过程中的重要性。主要的研究结果如下: 1.利用NCBI、ClustalX、GeneDoc软件对Solyc03g033560进行序列分析,发现Solyc03g033560包含了3个Ran BP锌指结构域,Ran BP型锌指结构域符合Ran BP2型锌指结构域的保守序列,所以把Solyc03g033560命名为:SlRBZ。从NCBI中blast找到和SlRBZ同源的其他物种中的RBZ基因,在植物中所有这些SlRBZ的同源基因的功能都是未知的,这表明番茄中的SlRBZ 基因以及在其他不同物种的同源基因可能具有重要的生物学功能。 2.组织表达谱分析表明SlRBZ基因在番茄各个组织中都表达,在茎中的表达量最高,叶片和根中次之。亚细胞定位分析结果显示SlRBZ所编码的蛋白定位于细胞核中。构建SlRBZ基因启动子驱动GUS-YFP 融合表达载体,转化番茄分析该基因的表达,结果表明该基因在茎和叶柄中有表达,说明SlRBZ可能在绿色组织茎和叶片中具有重要的功能。诱导分析表明SlRBZ基因受GA和IAA的正向调控,而受ABA的负向调控。 3.转基因功能分析确定SlRBZ 基因参与调控叶绿体的发育,同时影响叶绿素、类胡萝卜素和赤霉素的生物合成。将SlRBZ超量和干涉表达载体转化到番茄AC中,与番茄AC相比,发现SlRBZ的表达量在超表达植株中明显上调,在干涉表达植株中明显下调,并且超量表达SlRBZ 转基因番茄株系表现出明显黄化和矮化的表型。生理指标测定表明,超量表达SlRBZ转基因番茄植株中叶绿素、类胡萝卜素和赤霉素含量显然减少,Pn受到抑制。RT-PCR分析显示与叶绿素、类胡萝卜素和赤霉素这三种物质合成路径中相关的基因在超量表达SlRBZ 番茄转基因植株中的表达也是受到抑制的。 4.超微结构的观察表明,与番茄AC相比,超量表达SlRBZ转基因番茄植株叶片中细胞变小和气孔张开受阻,叶绿体发育受阻。 5.RNA-Seq转录组测序分析表明超量表达SlRBZ造成番茄转基因植株中叶绿素和光合作用代谢途径相关基因的表达受到抑制,还抑制了许多光捕获系统结合蛋白基因(Lhca/b)和叶绿体蛋白基因的表达,这与本研究的结果是一致的。 6.转录激活实验表明SlRBZ全长在酵母中没有转录激活的活性,可能在其不同片段的氨基酸结构域中具有转录激活功能。酵母双杂筛选到与SlRBZ互作的叶绿体通道外膜蛋白(OMP),并且在超量表达SlRBZ转基因植株中OMP是显著下调表达的,可能进一步抑制叶绿体的生物合成。