论文部分内容阅读
人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA）主要生理功能为运输功能和维持内环境相对稳定，具有抗凝血、清除自由基、维持血液正常的渗透压等功能。目前临床治疗中应用的HSA均来自人血浆提取，由于人血浆来源有限，产量远远不能满足市场需求。随着基因工程技术的发展，已有日本Mitsubishi TanabePharma公司、英国DELTA公司和华北制药致力于研究并推动酵母重组表达药用HSA的产业化进程。现有技术多采用毕赤酵母表达系统，通过甲醇控制醇氧化酶启动子（pAOX1）诱导表达重组人血清白蛋白（Recombinant Human SerumAlbumin，rHSA）。考虑到rHSA的临床治疗用量，生产中发酵规模至少为30000L，甲醇用量十分巨大，储藏和应用均非常困难，严重影响发酵生产的安全性。基于以上问题，本论文研究利用三磷酸甘油脱氢酶启动子（pGAP）的毕赤酵母表达系统重组表达rHSA，在发酵过程中仅使用甘油一种碳源，生产工艺简单且缩短了发酵周期，具体研究内容简述如下：本论文根据HSA的氨基酸序列及毕赤酵母对密码子的偏好性，将HSA基因进行了密码子优化，重组到pGAPZaA表达载体，用电转化法将目的基因导入X-33酵母基因组中，经Zeocin抗性培养基和PCR鉴定筛选出成功整合到酵母基因组的工程菌，菌株在摇瓶中培养，经SDS-PAGE和wsetern blot鉴定了rHSA的表达。菌株在发酵罐上进行培养，研究X-33组成型表达rHSA菌株发酵的最适发酵条件。将培养基的pH值分别调节至4.0、5.0和6.0，培养72h，测定表达量可知，pH=6.0的发酵罐rHSA表达量最高，因此，pH=6.0是X-33组成型表达rHSA菌株的最佳发酵pH值。研究了补充氮源的最佳方式，分别向四个发酵罐中补加无菌水、（NH4）2SO4、（NH4）H2PO4和H3PO4，培养72h，测定蛋白表达量可知，补加（NH4）H2PO4的菌株表达量最高，因此（NH4）H2PO4是X-33组成型表达rHSA菌株氮源最佳的选择。通过对rHSA发酵的中试工艺进行了初步的探索，为组成型X-33毕赤酵母菌表达的rHSA应用于工业生产打下基础。