链霉菌(Streptomyces)是生长于土壤中的好氧、具有丝状分枝细胞的革兰氏阳性细菌,属于原核生物界放线菌目链霉菌科。链霉菌对人类的生活和生命活动也起着十分重要的作用。在目前使用的抗生素中,大约有2/3是由链霉菌通过次级代谢途径所产生的。龟裂链霉菌(Slreptomyces rimosus)是土霉素(Oxytetracycline,OTC)的生产菌,土霉素是四环素类广谱抗生素,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体、衣原体、立克次氏体等引起的感染有效,因此具有良好的市场应用。由于Streptomycesrimosus基因组序列尚未测定与公开,为了了解该菌基因组的组成及其土霉素生物合成相关功能基因的基本信息,本文对Streptomyces rimosus的基因组进行了测定与拼接,并对相关功能基因进行了研究。具体结果如下：　　⑴S.rimosus基因组测序、注释与拼接。利用454 GS FLX测序仪,结合Illumina Solexa测序技术,完成了S.rimosus M4018的全基因组测序。对测序基因进行注释,绘制了基因组结构,包括初级代谢和次级代谢途径;同时对测序得到的contig进行拼接,完成了完整基因组的草图。测序结果表明:S.imosus基因组为线性,约为9.2Mb,GC含量71.96％。在该基因组中,通过注释预测有7744个开放阅读框(ORFs),其中615个预测蛋白是其特有的。基因组中含有6套核糖体RNA操作元,66个tRNA基因和1个tmRNA基因,并发现了编码气囊合成蛋白的8个基因以及RP2和RP3两个噬菌体基因簇。同时,S.rimosus M4018具有完整的糖酵解途径、磷酸戊糖途径和三羧酸循环过程。其完备的初级代谢途径,不但满足了自身生理活动的需要,而且可以把初级代谢产物(如前体、还原力等)提供给次级代谢途径,产生各种具有生物活性的次级代谢产物。在S.rimosus M4018中还发现了23个次级代谢相关的合成酶,可以产生PKS和NRPS类次级代谢产物。通过多序列比对和系统进化分析,发现了S.rimosus基因组结构和其他链霉菌属菌种具有很大的差异性,这可能是由于在整个进化树关系中,S.rimosus位于整个链霉菌家族的边缘位置有关。　　⑵野生菌G7和生产菌23383的Solexa测序与模式菌M4018基因组生物信息学上的进化分析。通过对野生菌G7和生产菌23383的Solexa测序,然后和M4018比对发现,S.rimosus G7中存在78个单核苷酸多态性(SNP),在S.rimosus23383菌株中有615个SNP。在这些SNPs之中,与OTC合成基因簇相关的基因中不存在任何SNP和插入缺失,然而在23383菌株中,发现一些初级代谢基因中存在着SNP,这些变化可能最终影响了OTC的生物合成。因为初级代谢可以提供次级代谢以各种前体、能量和还原力。　　⑶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)对土霉素生物合成影响。6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)是磷酸戊糖途径(PPP)中第一个酶,也是形成NADPH的关键酶。通过对此酶编码基因zwf的增强和阻断,研究了该基因对S.rimosus的OTC生物合成的影响。结果表明:zwf1或zwf2的阻断会影响葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的正常表达,但是土霉素的生物合成达到了50mg gDCW-1day-1和40mg gDCW-1 day-1,分别比原始菌提高了66％和33％。OTC产量的提高与碳源在PP途径和糖酵解(EMP)途径中的分配有关,前体物质丙二酰辅酶A的供应是限制性因素。对于阻断菌株zwf1和zwf2,经计算,△ATP/△NADPH的比率分别是11.4和7.8,比野生型菌株(4.1)要高,说明了碳代谢流更多的流向了EMP:途径,从而可以合成更多的丙二酰辅酶A。因此,提高抗生素产量的另一种方法是可以控制其代谢流的分布,即合理的利用碳源,从而提高抗生素的水平。　　⑷Rex蛋白基因克隆、氧化还原(Redox)感应的分子传感器构建与应用。Rex是一种NADH/NAD+氧化还原电位的感应分子,通过感应细胞内NADH/NAD+比率变化来调控相关基因的表达。本文对来源于S.rimosus M4018中的Rex蛋白进行了研究,首先从S.rimosus M4018基因组DNA中扩增出rex基因并进行了测序鉴定。然后,以大肠杆菌(Escherichiacoli)为模型,构建了氧化还原(Redox)感应的分子传感器系统,应用于研究胞内NADH/NAD+平衡对报告基因绿色荧光蛋白(gxeen fluorescentprotein,GFP)在不同氧条件下生物合成的影响。结果表明:此构建的redox传感器能够感应细胞中的氧浓度变化,当氧浓度高时,胞内NADH浓度低,。Rex和ROP的结合增强,报告基因GFP表达水平较低。反之,则增高。从而克服以前只是从胞外采用溶氧浓度(Dissolved oxygen,DO)传感器或氧化还原电位传感器间接研究胞内情况的不足。同时,也为该技术应用于其它微生物,如酵母、链霉菌等系统提供了技术平台。