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目的:当前糖尿病肾病(Diabetic nephropahty,DN)已成为导致终末期肾病维持性透析的主要病因,给家庭和社会带来了沉重的经济负担和精神压力。糖尿病肾病主要病理特征是肾小球系膜细胞肥大、细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)堆积进而发生肾小球硬化。megsin是近年来研究发现的一种在肾小球系膜细胞优势表达基因,其表达产物属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,serpin),因此而命名(mesangial cell-predominant gene with a homology to serpin)。Serpin的作用包括凝血、纤维蛋白溶解、细胞外基质代谢、炎症反应、细胞分化、增殖和凋亡等。已有研究发现,其在以系膜细胞增生、系膜基质积聚为主要病理改变的糖尿病肾病中,其基因与蛋白表达水平显著上调。megsin基因与蛋白的表达上调在糖尿病肾病发病机制中的作用目前已受到国内外学者的关注。高糖环境下系膜细胞中p38MAPK信号转导通路可被激活,进而使TGF-β1、炎症因子等表达上调;且PDGF-BB可能通过p38MAPK通路作用于肾小球系膜细胞,抑制细胞外基质的降解,促进细胞外基质如Ⅳ型胶原、FN的合成,从而参与肾小球硬化的过程。但在高糖刺激转染Megsin基因的系膜细胞是否会通过p38MAPK通路进而影响氧化应激及炎症因子的产生,促进DN的发展,目前国内外尚无研究。本课题通过转染Megsin基因,观察高糖环境中肾脏系膜细胞megsin、p-p38丝裂酶原蛋白激酶(p-p38MAPK)、细胞间粘附因子(ICAM-1)、巨噬细胞趋化蛋白(MCP-1)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)等表达的变化,以及通过转染Megsin siRNA基因,观察megsin低表达时高糖环境中肾脏系膜细胞上述各因子的表达情况,从而探讨megsin在糖尿病状态下系膜细胞中的作用机制,进一步寻找糖尿病肾病早期干预的新靶点,为人类早期防治糖尿病肾病提供实验性的理论依据。方法:建立稳定表达megsin的小鼠系膜细胞株(M组),应用脂质体2000瞬时转染megsin siRNA质粒系膜细胞(S组),同时设立野生型小鼠系膜细胞正常糖培养组(N组)、高糖培养组(D组)和空质粒对照+高糖培养组(V组),高糖环境中培养48小时,分别于12、24和48小时末收集各组细胞及上清,提取蛋白,应用western blot测定各组总蛋白中megsin、p-p38、ICAM-1、MCP-1的表达,比色法检测细胞培养液中SOD、GSH-PX、MDA含量的变化。免疫细胞化学染色,检测上述指标的表达,光镜下观察megsin、p-p38、ICAM-1、MCP-1等各项指标的阳性表达情况并进行定位、定性及半定量分析,结果用均数±标准差(x±s)表示,组间差异性比较采用单因素方差分析和q检验,显著性水平等于0.05,应用SPSS15.0软件包对所有数据进行统计学处理。结果:1 western blot结果:western blot显示在12h、24h、48h各时间点系膜细胞megsin、p-p38、ICAM-1、MCP-1蛋白表达水平N组、S组、D组、M组依次升高,组间比较差异有显著性(P<0.05),D组和V组相比差异无显著性(P>0.05);2细胞上清SOD、GSH-PX、MDA检测结果:在12h、24h、48h各时间点,N组、S组、D组、M组小鼠系膜细胞上清液中SOD、GSH-PX活性依次下降,组间比较差异有显著性(P<0.05),D组和V组相比差异无显著性(P>0.05),而N组、S组、D组、M组小鼠系膜细胞上清液中MDA活性依次上升,组间比较差异有显著性(P<0.05),D组和V组相比差异无显著性(P>0.05);3免疫细胞化学结果:免疫细胞化学染色显示megsin、ICAM-1及MCP-1主要在系膜细胞胞浆表达。高糖培养小鼠系膜细胞在12h、24h、48h各时间点上述各因子的表达水平N组、S组、D组、M组依次增强,组间比较差异有显著性(P<0.05)。D组和V组相比差异无显著性(P>0.05)。p-p38主要在系膜细胞胞核中表达,上述各时间点表达情况N组、S组、D组、M组依次增强,组间比较差异有显著性(P<0.05),D组和V组相比差异无显著性(P>0.05)。结论:1高糖环境下培养的系膜细胞中megsin的表达上调,且呈时间依赖性。2过表达megsin可上调系膜细胞p-p38、ICAM-1及MCP-1的表达,提示megsin可能促发高糖环境中系膜细胞增殖和氧化应激的发生,这与p38MAPK信号转导通路及其下游炎症因子的激活存在密切相关性。3通过megsin siRNA质粒转染下调megsin表达的同时高糖培养肾小球系膜细胞中p-p38、ICAM-1及MCP-1的表达亦下调,提示抑制megsin的表达可以通过抑制p38MAPK途径减轻高糖环境下系膜细胞的损伤,是早期防治糖尿病肾病的有效途径,为筛选防治糖尿病肾病的新靶点提供了实验性理论依据。