浒苔多糖协同蜂胶对H9N2亚型禽流感灭活病毒黏膜免疫效果的影响

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H9N2亚型禽流感病毒对养禽业危害很大,且对公共卫生安全也构成了严重威胁。目前,单纯使用灭活疫苗进行注射免疫对各毒株间交叉保护力较弱,尚不能完全防控H9N2禽流感疫情。研究发现,多糖和蜂胶均能有效提高疫苗的免疫效果。本文首先提取纯化了浒苔多糖(PEP),并对其理化性质和结构特征进行了研究,然后探讨了PEP和蜂胶合剂对灭活的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)诱导的系统和黏膜免疫反应的影响,为开发新型黏膜免疫佐剂提供理论依据,其主要研究内容如下:1.PEP的分离纯化及结构鉴定采用水提醇沉法提取PEP,并采用DEAE-纤维素柱层析和凝胶过滤层析,分离纯化得到均一的PEP。然后采用苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法、硫酸-咔唑法和氧瓶燃烧法分别测定PEP的总糖、蛋白、糖醛酸和硫酸基的含量。采用紫外光谱法(UVS)、红外光谱法(FT-IR)、高效液相色谱(HPLC)、分子排阻色谱法(SEC)、扫瞄式电子显微镜(SEM)和核磁共振波谱法(NMR)等方法分析PEP的结构特征。采用示差扫描量热分析(DSC)和热重量分析(TGA)方法检测了PEP的热力学性能。结果显示,PEP提取率为1.926%,PEP的糖含量为90.21%,蛋白和硫酸基含量均低于1%;红外光谱图显示,PEP具有多糖的典型特征吸收峰;分子量分布显示,PEP有两个不同的保留时间且对应两个对称的窄峰,表明PEP的纯度和分子量均一性均较高,其相对分子量为6.3×1031.17×105Da;单糖组成分析发现,PEP主要由葡萄糖(58.23%)、半乳糖醛酸(11.04%)、阿拉伯糖(9.34%)和木糖(8.01%)组成;1H-NMR和13C-NMR图谱显示,PEP的主链可能主要是以β-D-1,3-Glcp连接形式为主,并有少量α-L-1,6-Arap存在;DSC发现PEP的固态主体结构突变发生在84.61℃左右,而TGA发现PEP第2部分质量丢失的温度为T0=268.37℃,Tp=318.82℃,最后残留量为18.1%;SEM图显示,PEP表面呈质地较脆的片状结构。2.PEP与蜂胶口服合剂(PPO)对灭活的H9N2亚型AIV免疫反应的影响:280羽雏鸡随机分为7组,除空白对照组外,均于14日龄口服免疫灭活的H9N2亚型AIV,0.3ml/羽,28日龄二免。每次免疫的同时,13组分别按4mg/只、2mg/只、1mg/只的剂量灌服PPO;4、5组按2mg/只分别灌服PEP和蜂胶;6、7组灌服相应剂量的生理盐水;每天1次,连续灌服3d。(1)血清中免疫指标的检测结果:测定免疫后7d、14d、21d、28d和35d血清HI抗体效价、特异性IgG和Ig A抗体、血清IL-4和IFN-γ含量的变化。结果显示,PPO中、高剂量组在全部检测点的HI抗体效价、在1435d的4个时检测点的IFN-γ和IL-4含量均显著高于病毒对照组(P<0.05);在721d与病毒对照组相比PPO的3个剂量组中的特异性IgG和IgA抗体水平均显著提高。结果表明,PPO配合灭活的AIV口服免疫能显著提高鸡群的系统免疫应答反应,且在中、高剂量时的效果较好。(2)肠道黏膜免疫相应指标的检测结果:分别于免疫后7d、21d、35d,每组随机抽取6只鸡,测定小肠洗液中sIgA和IL-17含量,检测小肠IEL、肥大细胞和IgA+细胞的数量。结果显示,在免疫后所有时间点,PPO中、高剂量组小肠洗液s IgA及IL-17的含量、小肠黏膜IEL、肥大细胞以及IgA+细胞的数量均显著高于病毒对照组,且在部分检测点显著高于PEP和PF组。结果表明,PPO配合灭活AIV口服免疫能显著增强鸡体肠道的黏膜免疫反应,且在中高剂量时的效果较好。
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