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乳杆菌是普遍应用的益生菌,能够产生有机酸、过氧化氢、细菌素以及类细菌素等抑菌物质,抑制腐败菌与病原菌的生长,调节微生态平衡,目前主要应用于胃肠道与泌尿生殖系统。由于其产酸耐酸特性,传统的观点认为乳杆菌促进了龋齿的发展,口腔中益生乳杆菌的研究与应用非常少,促进龋病发展与防治龋病的乳杆菌之间的本质区别没有公认,对比健康与龋患两种生理状态下口腔乳杆菌的微生态组成,研究口腔中的益生乳杆菌具有重要意义。
从成年人舌背与唾液中分离乳杆菌,研究健康与龋患两种生理状态下口腔乳杆菌微生态组成,发现舌背乳杆菌各发酵类群(专性同型、兼性异型与专性异型发酵)所占的比例差异不显著,表面酸、碱电荷分布的差异也不显著;而唾液中的菌株的组成与表面性质的差异高度显著;龋患宿主唾液中兼性异型发酵类型的菌株所占比例高达70%;健康宿主唾液中菌株的表面疏水率与酸碱电荷都较高,主要分布在60%-100%之间,而龋患宿主唾液中菌株的表面疏水率与酸碱电荷都较低,集中在60%以下,证明健康与龋患宿生唾液中乳杆菌的微生态组成不同,健康宿主的口腔是功能性乳杆菌的合适筛选源。
从健康宿主口腔中筛选到一株对致龋菌具有抑制作用的乳杆菌HO-69,经API细菌鉴定系统鉴定与16S rDNA全长序列分析,确定HO-69菌株为植物乳杆菌,命名为L.plantarum HO-69。
研究了L.plantarum HO-69的益生特性。模拟牙面与牙本质的黏附实验表明,L.plantarum HO-69对于唾液包被毛细管以及唾液包被牙本质粉的黏附率非常低,其引发或者促进龋齿发展的概率很低,满足在口腔中应用的前提条件;模拟胃肠消化试验表明,L.plantarum HO-69对于人工消化液具有良好的抗性,在正常的生理胆汁浓度中能够生长,说明菌株能以活菌状态到达胃肠道,对肠道菌群产生影响。
L.plantarum HO-69产生的抑菌物质具有优良的性能:能够被胰蛋白酶降解;具有良好的热稳定性;在酸性pH范围内显示活性,活力随pH的降低而增强;对变形链球菌等革兰氏阳性菌以及大肠杆菌AS 1.543等革兰氏阴性菌具有抑制作用,但对枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌ZS2058以及酿酒酵母没有抑制作用;将其命名为plantaricin HO69。
对plantaricin HO69进行纯化。经过正丙醇萃取、Sephadex G-15凝胶过滤层析、SP-sepharose FF离子交换层析、半制备型HPSEC与制备型RP-HPLC一系列分离纯化手段,在分析型RP-HPLC得到一个单峰,此时plantaricin H069的比活力为91428 AU/mg。
MALDI-TOF-TOF MS鉴定plantaricin HO69的相对分子质量为1027.57,N端氨基酸序列为NH<,2>-Lys-Leu-Asn-Thr-Gly-Ser-Arg-Pro-Arg,通过数据库对比,plantaricin HO69与其它抗菌肽不同,是一个新的抗菌肽。
为提高plantaricin HO69的产量,对L.plantarum HO-69的培养条件进行了研究,选择MRS为基础培养体系,设计部分因子重复实验进行回归分析,回归分析表明:抗菌肽plantaricin HO69的产生与菌体的生长不完全同步,K<,2>HPO<,4>与牛肉膏是plantaricinHO69产生的显著正影响因子。综合考虑抗菌肽活力与纯化的难度,确定K<,2>HPO<,4>与牛肉膏的浓度分别为12 g/L 与16 g/L,蛋白胨浓度为6 g/L。响应面分析确定plantaricinHO69产生的最适培养条件为发酵时间13.87 h、培养温度36.12℃、培养基起始pH值6.61。在此条件下发酵液的效价由80 AU/mL提高到320 AU/mL,plantaricin HO69的产量增加为原来的4倍。