研究背景癌痛的治疗一直是临床上的难题,随着对恶性肿瘤的诊断和治疗技术的不断进步,癌性疼痛已经成为严重影响患者生活质量和生存率的主要问题。75%-90%的转移性恶性肿瘤患者会发生严重的癌性疼痛。恶性肿瘤,如前列腺癌,乳腺癌和肺癌等,均易发生骨转移,引起病理性骨痛,即骨癌痛。骨癌痛性质严重,而且发生率极高。目前对于骨癌痛的治疗主要依赖阿片类药物,但随着时间的延长,其用量逐渐增大,并产生严重的副作用,如成瘾,耐受,恶心,呕吐,便秘和呼吸抑制等。因此极有必要寻求一种基于疼痛机制性的,具有高效、作用持久、毒副作用小等优点的新的治疗方案。骨癌痛动物模型的建立为研究者提供了研究骨癌痛复杂机制和探索更有效靶向药物治疗的契机,特别是大鼠胫骨转移性癌痛模型,其与人类骨癌痛的发生机制有诸多相似之处,能较好的模拟人类转移性骨癌痛的发生,具有重大的研究意义。在此实验模型中,侵袭性肿瘤细胞被注射到大鼠股骨或胫骨骨髓腔。随着肿瘤的生长和骨质破坏,可产生一系列行为学,细胞学和神经生化学改变。Walker256乳腺癌细胞具有明显的骨侵袭能力,常用于建立大鼠转移性胫骨癌痛模型。因此,本研究拟采用Walker256乳腺癌细胞建立大鼠胫骨转移癌痛模型,为下一步的研究奠定基础。脑干中的某些结构会向脊髓发出“下行，，信号,调控来自脊髓背角的痛觉信息向中枢的传递,并参于各种痛觉相关信息的整合和处理,是疼痛调节的高级中枢。因此,在脊髓上水平完全阻断伤害性信号的上行或下行性传导,有望成为治疗顽固性疼痛的理想策略。延髓头端腹内侧区(rostral ventromedial medulla, RVM)是脑干下行调控系统的重要结构,其内有富含5—羟色胺的中缝大核(nucleus raphe magnus, NRM),网状巨细胞核α部(gigantocellularis pars alpha)和外侧网状巨细胞核等神经核团。RVM区接受并整合来自中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray, PAG)的信息,其内神经元轴突沿脊髓背侧束(dorsolateral funiculus, DLF)下行并终于脊髓,构成了疼痛信号下行调控系统的主要输出通路,并能易化或抑制脊髓痛觉信号传递。因此,毁损RVM区易化神经元是削弱慢性疼痛下行易化调控系统作用,治疗顽固性疼痛的有效方法。以往有研究者利用颅内微注射的方法,在慢性疼痛模型大鼠RVM区内注射利多卡因封闭其易化神经元的功能,虽然达到了良好的镇痛效果,但随着药物代谢,其镇痛作用逐渐消失；也有研究者将神经毒素—皂角素注射到慢性疼痛模型大鼠的RVM区,毁损RVM区神经元,这种方法虽然可以获得持久的镇痛效果,但由于神经元坏死,不可避免的会诱发周围神经组织炎性免疫反应。RVM区调控机体呼吸,心率,血压,体温,运动等重要生理功能。神经元坏死产生的化学物质所诱发的炎性及免疫反应,很可能对机体正常生理功能产生严重的影响。Caspase 3是多数细胞凋亡途径中的末端效应蛋白酶,但其活化需要外源刺激及上游一系列caspase分子级联反应。Srinivasula等通过分子生物学的方法模拟caspase3在细胞内的活化过程,将其大、小亚基序列颠倒后,构建了无需外源刺激或上游caspase分子作用,就可自发活化的人源性重组caspase3基因,直接介导靶细胞凋亡,可作为基因治疗领域一个极好的细胞致死基因。但人源性基因可能会诱发实验大鼠免疫反应,干扰实验结果的准确性,因此,本研究拟通过构建大鼠源性重组Caspase3基因,并将其与非病毒载体PEI共同定向微注射到胫骨转移癌痛模型大鼠RVM区,启动RVM区神经元自发凋亡,达到“永久”性治疗骨癌痛的效果。研究方法与结果1、大鼠源性重组caspase3基因的构建及促凋亡效应评价方法：提取大鼠星形胶质瘤C6细胞总RNA后,通过逆转录PCR的方法得到cDNA。根据Genbank中caspase3基因的序列分别设计其大、小亚基的引物,并通过重组PCR的方法获得大小亚基顺序颠倒的大鼠源性重组caspase3基因(Remcasp3)。将Remcasp3分别定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1+和C1后分别转染人胚肾293T细胞和大鼠永生化神经干细胞,观察细胞形态学变化,通过Annexin V-PI双染、流式细胞术、MTT法来检测其促细胞凋亡作用,透射电镜检测其凋亡微形态学改变。结果：成功构建出大小亚基顺序颠倒的大鼠源性重组caspase3基因片段,测序结果与预期结果相一致。转染C1-Remcasp3后,INPC及293T出现明显凋亡细胞。电镜下可见胞质浓缩,核染色质边集,并有凋亡小体的形成等典型的细胞凋亡的特征。MTT检测结果提示两种细胞的增殖明显被抑制(INPC:44.61±0.15%; 293T:48.35±0.16%),与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。Annexin V-PI共染色流式细胞术检测两种细胞的凋亡率(INPC:16.002±0.99%; 293T:30.667±1.52%),与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。2、大鼠骨癌痛模型的构建及评价方法：将培养的Walker 256大鼠乳腺癌细胞注入大鼠腹腔内。接种6-7d后收集癌性腹水,经处理后用于胫骨接种。雌性SD大鼠32只,随机分为4组,每组8只。Ⅰ为正常对照组；Ⅱ为D-Hank’s组：将10μl无菌D-Hank’s溶液注射至大鼠右侧胫骨上段骨髓腔；Ⅲ为热灭活细胞组：于大鼠右侧胫骨上段骨髓腔注射热灭活的Walker256乳腺癌细胞悬液10μl；Ⅳ为骨癌痛模型组：于大鼠右侧胫骨上段骨髓腔注射有活性的Walker256乳腺癌细胞悬液10μl。分别于模型制备前一天,当天,至术后第十五天,每天检测机械性痛觉超敏,机械性痛觉过敏和移动诱发痛,并于模型制备后第15天进行后肢X射线检查。放射学检查后,分别进行大鼠脊髓GFAP,OX42免疫荧光染色和脑干RVM区及脊髓匀浆高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)检测中枢神经系统谷氨酸的浓度。结果：骨癌痛模型组大鼠出现了明显的痛觉行为学改变,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。接种了有活性的肿瘤细胞后第十五天进行放射学检查,在术侧胫骨注射部位及周围出现较严重的骨质破坏,骨皮质缺失,而对照组大鼠术侧骨皮质完好,未发现骨质破坏。激光共聚焦检测大鼠脊髓GFAP,OX42免疫荧光发现,骨癌痛组大鼠GFAP标记的星形胶质细胞和OX42标记的小胶质细胞明显活化,胞体增大,数量增多。高效液相色谱结果显示：骨癌痛组大鼠RVM区和脊髓兴奋性氨基酸谷氨酸含量均显著升高,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。3、RVM区靶向注射In-vivo jetPEI/重组caspase3基因复合物在骨癌痛大鼠的镇痛效应评价方法：鉴定pcDNA3.1+-Remcasp3单克隆菌种,扩增后进行性质粒大量制备,并计算质粒DNA的纯度和浓度。在无菌条件下将质粒DNA与非病毒载体In-vivo jetPEI按一定比例混匀后溶于10%无菌葡萄糖溶液中,再加入无菌双蒸水使葡萄糖的终浓度为5%。在实验大鼠接种有活性的肿瘤细胞10～12天后,以丙泊酚麻醉实验大鼠(50μg/100g i.p.),置于脑立体定位仪上,依据RVM区的解剖位置(前后位：距前囟11mm；左右位：距正中线各旁开0.6mm；背腹位：距颅骨8.5mm)。将药物缓慢注射入双侧RVM区(左右各1μl)。停留片刻后,缓慢退出微量加样器。分别在立体定位注射前一天,当天,至手术后第七天,每天进行痛觉行为学检测。立体定位注射DNA/PEI混合物后48h,分别取Remcasp3组和正常对照组大鼠RVM区,制备组织块石蜡切片,进行Tunel检测；制备脊髓切片进行GFAP,OX42免疫荧光染色；取脑干RVM区及脊髓匀浆以高效液相色谱(HPLC)法检测中枢神经系统谷氨酸的浓度。结果：RVM区内微注射前,各组骨癌痛大鼠机械缩爪阈值,缩爪反应时间和移动诱发痛觉评分无统计学差异。RVM区内立体定位注射重组质粒／PEI混合物24h后,大鼠机械性缩爪阈值明显升高,缩爪反应时间明显缩短,移动诱发痛觉评分显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。Tunel检测结果显示RVM区可见大量凋亡细胞。HPLC检测结果显示骨癌痛组大鼠RVM区和脊髓内谷氨酸含量在靶向注射重组自杀基因／PEI复合物后显著下降。与癌痛组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。在免疫荧光实验中,骨癌痛组大鼠GFAP标记的星形胶质细胞和OX42标记的小胶质细胞明显活化,数量增多,而颅内微注射重组质粒／PEI复合物后,星形胶质细胞和小胶质细胞的活化明显受到抑制,活化细胞数量显著减少。4、RVM区内靶向注射重组caspase3/In-vivo jetPEI的安全性评价方法：分别于RVM区微注射前,及手术后当天,第1天,第2天,第3天至第7天分别测量Naive组,PEI组,5%Glucose组,PEI+5%Glucose组和Remcasp3组大鼠体重,直肠温度,呼吸频率和心率值。结果：术前各组大鼠生理参数基础值无统计学差异,RVM区微注射后整个观察期内,各组大鼠体重、直肠温度、呼吸频率、心率等生命体征参数之间均无显著差异(P＞0.05)。5、统计学处理采用SigmaStat 3.0统计软件进行处理。计量资料以均数±标准差((?)±s)表示,行为学测定及其余计量资料采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。研究总结一主要研究结果1、大鼠源性重组caspase3基因可在真核细胞中表达,并在无外源性刺激下直接诱导细胞发生凋亡。2、RVM区内注射In-vivo jetPEI/重组caspase3基因复合物能诱发其神经元凋亡,并可对骨癌痛大鼠产生显著,完善,持久的镇痛效果。3、骨癌痛大鼠中枢神经系统兴奋性氨基酸谷氨酸含量显著升高,脊髓星形胶质细胞,小胶质细胞明显活化,数量增多；诱导RVM区神经元凋亡后,中枢神经系统谷氨酸水平显著下降,脊髓星形胶质细胞,小胶质细胞活化水平显著下降。4、RVM区单次注射,并且诱导其内神经元凋亡不会对实验大鼠的运动功能和生理功能产生显著的影响。二、研究结论1、本研究构建的大鼠源性重组caspase3基因能够在真核细胞中表达,并在无外源刺激和上游活化的情况下直接诱导神经细胞与非神经细胞自发凋亡,为基于免疫功能正常的实验大鼠相关疾病的研究和治疗提供一种新型有效的细胞杀伤基因,并为神经系统难治性疾病的基因治疗提供了又一种有效的目的基因。2、与神经病理性痛和炎性痛的发生机制相似,RVM区在骨癌痛的产生和维持中也起到重要作用。以凋亡的方式毁损RVM区易化神经元能够起到有效并且安全的镇痛作用。3、非病毒阳离子载体PEI能将目的基因安全,高效地转染至中枢神经系统。4、中枢神经系统兴奋性氨基酸谷氨酸水平,脊髓星形胶质细胞,小胶质细胞的活化状态与骨癌痛的发生发展显著相关。5、立体定位引导下RVM区单次注射DNA/PEI混合物未对实验动物的生理功能产生明显影响,提示RVM核团的靶向毁损可以发挥有效、持久和完善的镇痛效果,且具有较高的安全性,为顽固性疼痛治疗提供了一个有效的脊髓上治疗靶点。