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研究背景:砷（arsenic,As）是自然界与职业环境中一种常见的类金属污染物,广泛存在于水、食物、空气、土壤以及有色金属冶炼和矿石开采过程中,其中无机砷饮水暴露已经对全球人类健康构成了巨大的威胁。在孟加拉国、印度、南美、中国以及美国的部分地区地下水中,均发现了无机As含量超过世界卫生组织（World Health Organization,WHO）与美国环境保护署（United States Environmental Protection Agency,USEPA）所制定的10μg/L可接触剂量限值的情况。继往流行病学研究表明,无机As暴露与多种人类代谢紊乱性疾病发生有着密切的联系,如II型糖尿病、肥胖以及代谢紊乱综合征等。此外,众多动物实验研究表明,无机As暴露能够通过干扰血糖代谢、血脂代谢以及能量代谢等途径来诱导代谢紊乱的发生,如As暴露可导致肝脏糖原合成异常、胰腺功能受损、肌肉胰岛素抵抗以及棕色脂肪产热异常等。目前大多数研究主要集中于探究高剂量As暴露与代谢紊乱之间的关系,关于环境相关剂量As暴露是否诱导代谢紊乱发生,尚缺乏证据;在As暴露诱导代谢紊乱的研究中,目前主要集中于参与代谢调控的外周器官功能的受损,而对中枢调控代谢的机制报道较少,尤其是对于代谢调控中枢下丘脑在其中的作用尚未见有文献报道。因此,本研究旨在探讨环境相关剂量As暴露对代谢紊乱的影响,以及代谢中枢下丘脑在其中的调控作用。该研究对理解环境有害因素与代谢紊乱性疾病发生之间的关系具有重大意义。研究方法:1.As暴露对小鼠代谢稳态与脑葡萄糖感受性的损伤效应研究采用可溶性亚砷酸钠（arsenite,Na As O2）通过饮水暴露的方式对C57BL/6J成年小鼠实施100μg/L浓度的As暴露14周,建立慢性低剂量As暴露小鼠模型;通过腹腔注射葡萄糖耐量实验（Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）,胰岛素耐量实验（Insulin tolerance test,ITT）,胰岛素分泌实验（Insulin secretion test,IST）,随机或空腹血糖与胰岛素水平检测,评价慢性低剂量As暴露对小鼠葡萄糖代谢稳态的损伤效应及特性;通过检测小鼠耗氧量（Volume of oxygen consumption,VO2）与二氧化碳排出量（Volume of carbon dioxide production,VCO2）、计算呼吸熵（respiratory exchange ratio,RER）、检测能量消耗（energy expenditure,EE）与小鼠肩胛间表皮温度以及测量空腹血清甘油三酯与总胆固醇的含量,以此来评价慢性低剂量As暴露对小鼠能量稳态平衡的损伤效应及特性;此外,通过测量小鼠脑及下丘脑葡萄糖吸收,检测下丘脑c-FOS阳性细胞数目以及POMC神经元c-FOS阳性细胞数目,来探讨慢性低剂量As暴露对小鼠脑及下丘脑POMC神经元葡萄糖感受性的损伤效应及特点。2.As暴露对神经胶质细胞的毒性效应及机制研究在低剂量As暴露条件下,采用CCK-8结合细胞形态观察的方式来明确As对两种胶质细胞的整体损伤效应;其中针对原代星型胶质细胞,采用免疫荧光染色,葡萄糖吸收检测以及糖原合成检测的方式来评价As对原代星型胶质细胞突起可塑性、葡萄糖吸收以及糖原合成的影响;针对少突胶质前体细胞Oli-neu细胞株,则采用细胞总ROS检测、线粒体ROS检测、线粒体膜电位与ATP产生检测以及细胞凋亡检测,来明确As对Oli-neu细胞的神经毒性效应与机制,并应用抗氧化剂NAC预处理Oli-neu细胞,通过检测细胞活性、细胞总ROS、线粒体ROS、线粒体膜电位及ATP产生以及细胞凋亡来明确NAC对As诱导的Oli-neu细胞毒性的保护效应与机制。3.SOX2在As诱导的星型胶质细胞突起可塑性损伤与小鼠代谢紊乱中的作用及机制研究继续采用慢性低剂量As暴露小鼠模型来进行机制研究,通过免疫荧光染色来评价As暴露对下丘脑星型胶质细胞突起可塑性的影响;采用免疫荧光染色来评价As暴露对小鼠下丘脑星型胶质细胞对血管与POMC神经元包裹的影响,明确As诱导的POMC神经元葡萄糖感受性下降的潜在机制;通过Western blot技术检测下丘脑组织中SOX2与INSR的表达以及AKT的磷酸化情况,明确As暴露对SOX2与INSR/AKT信号通路的影响规律与特点;构建星型胶质细胞特异性敲除SOX2的小鼠模型,检测在As暴露后小鼠葡萄糖耐受与胰岛素抵抗情况,以此来明确SOX2在As诱导的葡萄糖代谢紊乱中的重要作用;利用星型胶质细胞特异性敲除SOX2的小鼠模型与细胞模型,通过免疫荧光染色的方法来明确SOX2缺失在As影响小鼠下丘脑POMC神经元葡萄糖敏感性、星型胶质细胞对POMC神经元的包裹以及下丘脑星型胶质细胞与原代星型胶质细胞的突起可塑性中的作用,并通过Western blot技术揭示SOX2缺失在As暴露影响下丘脑与原代星型胶质细胞的INSR/AKT信号通路中的作用,以此来明确SOX2在调控As诱导的小鼠代谢紊乱、POMC神经元葡萄糖敏感性下降、星型胶质细胞突起可塑性受损以及INSR/AKT信号受阻中发挥的重要作用。研究结果:1.As暴露对小鼠代谢稳态与脑葡萄糖感受性的损伤效应研究在100μg/L As饮水暴露12周后,小鼠出现空腹血糖、空腹血清甘油三酯与总胆固醇水平升高以及IPGTT曲线下面积减少等异常代谢表型;在As饮水暴露13周后,小鼠出现胰岛素抵抗异常代谢表型;在As饮水暴露14周后,小鼠出现VO2减少,VCO2减少,RER降低、EE降低以及肩胛间表皮温度降低等异常能量代谢表型;此外As暴露还降低了小鼠脑葡萄糖摄取量以及下丘脑POMC神经元的葡萄糖感受性。2.As暴露对神经胶质细胞的毒性效应及机制研究在4μM As处理24小时后,原代星型胶质细胞突起分枝数目以及初级长度相比对照组显著降低,并伴有葡萄糖吸收降低与糖原合成减少等损伤效应;此外,4μM As处理24小时还显著降低了原代星型胶质细胞的SOX2蛋白表达以及抑制了INSR/AKT信号通路;更进一步地,8μM As暴露24小时引起了Oli-neu细胞活性的下降、氧化应激水平的增加、线粒体功能失调以及细胞凋亡率的上升;而NAC的预处理能够显著拮抗As暴露所诱导的Oli-neu细胞活性的下降、氧化应激水平的增加、线粒体功能失调以及细胞凋亡率的上升。3.SOX2在As诱导的星型胶质细胞突起可塑性损伤与小鼠代谢紊乱中的作用及机制研究100μg/L As饮水暴露14周显著损害了小鼠下丘脑星型胶质突起可塑性、降低了星型胶质细胞对血管和POMC神经元的包裹,显著降低了小鼠下丘脑组织中SOX2的表达,以及抑制了INSR/AKT信号通路;特异性敲除星型胶质细胞SOX2表达加剧了As所诱导的葡萄糖代谢紊乱、下丘脑星型胶质细胞突起可塑性的损伤、POMC神经元的葡萄糖感受性下降,以及INSR/AKT信号通路的抑制;过表达原代星型胶质细胞SOX2显著逆转了As所诱导的星型胶质细胞突起可塑性的受损,以及INSR/AKT信号通路的抑制。研究结论:根据本课题研究结果,获得以下结论:（1）慢性低剂量As暴露能够诱导小鼠葡萄糖代谢紊乱以及能量稳态失衡;（2）慢性低剂量As暴露能够损伤小鼠下丘脑POMC神经元葡萄糖感受性;（3）慢性低剂量As暴露能够损伤下丘脑星型胶质细胞突起可塑性;（4）SOX2介导的INSR/AKT信号参与调控了As暴露对星型胶质细胞突起可塑性、POMC神经元葡萄糖感受性以及小鼠葡萄糖代谢稳态的损伤作用;（5）低剂量As暴露通过损伤线粒体功能和诱导异常氧化应激的途径导致Oli-neu细胞凋亡,而NAC的预处理可拮抗As所诱导的神经毒性效应;本课题研究为慢性低剂量As暴露诱导小鼠代谢紊乱及其神经胶质细胞毒性提供了新的实验证据,同时揭示了慢性低剂量As暴露诱导代谢紊乱性疾病发生的一个新的中枢调控机制,这将对全面理解环境有害因素与代谢紊乱性疾病发生之间的关系具有重要的意义。